白藜芦醇对脓毒症休克大鼠心功能的保护作用及机制

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1、分类号：! Z 垄 密级：坌翌 妒氟 单位代码：1 0 1 5 9 学号：2 Q ! 1 2 Q Z ! Z 豺太孥 硕士学位论文 ( 学术学位申请硕土学位) 中文题目：白藜芦醇对脓毒症休克大鼠心功能的保护作用及机制 英文题目： P t e ct lv e E t f e cco f R e s v e r a 仃o lo n M 叮o ca r d im D y s 矗m ct io n in S e p t lc S h o ckR a lsa n d SM e clla lllz m 论文作者：圭壁堕 指导教师：型叠竖墼攫 学科专业：些盟茔 完成时间：! ! ! ! 主28 吲翅 M -

2、 彩磐攀懋 中国医科大学硕士学位论文 白藜芦醇对脓毒症休克大鼠心功能的保护作用及机制 P r o t e ct iv ee f - f e cto fr e s v e r a t r 0 1o nt h em y o ca r d ia l d y s f u n ct io n in s e p t ic s h o ckr a t sa n dit sm e ch a n iz m 申请学位一 垦堂亟圭 一级学科 堕盛匡堂 论文起止时间至Q ! 曼主呈旦二2 鱼! Z 主至旦 论文完成时间2 鱼! Z 主至旦 中国医科大学( 辽宁) 2 0 17 年2 月 | | | | | I I I

3、 | | | l| | | | | lJ | l| j j | I I | | I | lJ l| I | | | j l 中国医科大学学位论文独创性声明丫墨；鱼7 了4 2 本人郑重声明：本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工 作及取得的研究成果，论文中除加以标注的内容外，不包含其他人或 机构已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而 使用过的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均己在文中进行 了明确的说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人 承担。 论文作者签名：袖 日 期：M 年月 町 年乡月多日 指导教师签名： 日期：切7 年月日 中国医科大学硕士学位论

4、文 中文摘要 目的：脓毒症是由感染引起宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能障碍， 是感染、烧伤、严重创伤、外科大手术等的常见的并发症，其进一步进展可表现为 脓毒性休克并伴随全身各器官功能损伤，其中以心肌损伤最为常见且病死率较高。 心肌损伤机制十分复杂，包括血容量及微循环改变，钙离子通道数量减少、炎性介 质损伤及线粒体损伤等，其中以内质网应激介导的心肌细胞凋亡为心肌损伤的重要 发病机制。治疗上，早期的液体复苏、抗生素治疗及血管活性药物的应用己得到广 泛认可，对于上述治疗仍不能维持血流动力学稳定者，可早期联合小剂量糖皮质激 素治疗。白藜芦醇是天然存在的非黄酮类多酚化合物，具有强大的抗氧化、抗肿瘤

5、、 抗衰老、抗炎症等生物学特性，作为s ir t l特异性激动剂，白藜芦醇能增加s ir t l 在脑、心、肾、肌肉及脂肪组织中的表达并对组织产生保护作用。目前，对S j r t l减 轻心肌细胞在应激状态下的损伤机制研究广泛，但还有很多机制尚未明确，大量研 究表明在大鼠肝脏、肾脏及软骨细胞中增加S ir t l蛋白表达可以减少内质网损伤标 志物的产生，说明S ir t l可以调节内质网应激反应，而在脓毒症休克大鼠模型中 S ir t l是否通过调节内质网应激对心肌细胞产生保护作用有待进一步证实。本研究 采用静脉注射内毒素( L P S ) 的方法制作大鼠脓毒症休克模型，以观察白藜芦醇对 脓毒

6、症休克大鼠心功能的影响及其作用机制，并将其作用效果与糖皮质激素地塞米 松相比较。 研究方法：将3 2 只雄性w is t a r 大鼠随机分为4 组：空白对照组( co n 组) 、 脓毒症休克组( L P S 组) 、白藜芦醇组( R S V 组) 、地塞米松组( D X M 组) 。实验组 通过静脉注射2 0 m g k g 内毒素( L P S ) 溶液建立脓毒症休克大鼠模型，对照组静脉 注射等体积生理盐水。大鼠麻醉固定后通过右侧颈动脉插管术监测大鼠左室内压及 左室功能，经股动脉置管监测大鼠平均动脉压( M A P ) ，当M A P 较基础值降低3 0 时视为脓毒症休克模型，造模成功后

7、R S V 组及D x M 组经股静脉分别注射5 0 m g k g 白 藜芦醇溶液及2 m g k g 地塞米松溶液，C o n 组及L P s 组经股静脉注射等体积含o 3 二甲基亚砜的生理盐水，4 小时后留取血清及心肌组织标本，观察各组大鼠心肌组 织的形态学变化，血清炎症介质T N F _ a 表达情况及心肌组织中S I R T l、G R P 7 8 的蛋 白和m R N A 表达水平。 中国医科大学硕士学位论文 结果：与co n 组相比，L P s 组大鼠心功能降低，心肌细胞损伤明显，血清T N F a 含量升高( P 0 0 5 ) ：与L P S 组比较，R S v 组及D X

8、M 组的心率下降，左室舒张功 能得到改善( P O 0 5 ) ，二者之间无显著差异；R S V 组及D X M 组S ir t l的蛋白表达 含量及m R N A 表达较L P s 组升高，G R P 7 8 的蛋白表达含量及m R N A 表达降低( P O 0 5 ) ， 且R S V 组G R P 7 8 含量下降明显( P O 0 5 ) 。 结论：白藜芦醇通过抑制内质网应激反应对脓毒症休克大鼠心肌损伤起到保护 作用，且效果可能优于地塞米松。 关键词：脓毒症休克；白藜芦醇；内质网应激；心功能；心肌损伤 课题资助：国家自然科学基金( N o ，8 1 3 7 2 0 3 9 ) 中国医

9、科大学硕士学位论文 A b S t r a ct O b j e ct iv e ：S e p s isisaco m m o nco m p lica t io no fin f e ct io n ，b u m s ，s e V e r et r a u m a ， s u 玛e r ya n do 1 e rm 旬o rs u r g e r y I t sf u n h e rp r o g r e s sca nb em a n if e s t e da ss e p t ic s h o ck a 1 1 da s s o cia t e dw i虹1V a r io u so

10、耀a nd y s f lu n ct io n M y o c甜d ia lin j u r yis 吐lem o s tco m m o n 肌dh a sh i曲m o r t a lit y M y o ca r d ia l埘u r ym e ch a n iS misco m p le x ，in clu d in gb lo O d v o lu m ea n dI I licr o cir cu la t io nch a J lg e s ，m en u m b e ro fca lciu mch a n n e lsd e cr e a s e d ， in f la m

11、m a t o r y m e d ia t o r sa n dm it o ch o n d r ia l d a H la g e ，e n d o p la S m ic r e t icu lu m s t r e s s - m e d ia t e dca r d io m y o cy t e 印o p t o s isisa nim p o n a n tp a t h o g e n e s iso fm y o ca r d ia l 埘u R e s v e r a 拉。l isan a t u r a 儿yo ccu m n gn o n n a V o n o id

12、p o ly p h e n 。l co m p o u n dw it h s t r o n ga 1 1 t io x id a n t ，a n t i- t 啪o r ，a J lt i- a g in g ，a n 僖in n 锄m a t o r ya n d o 廿le r b io lo g ica l p r o p e r t ie s A sS I R T ls p e cm ca g o n is t s ，r e s V e r a t r o l ca nin cr e a S eS I R T 】inb r a in ，h e a n ， k id n e y

13、，m u s clea n da d ip o s et is s u ea n dp r o t e ct S ir t l h a saw id er a n g eo fm e ch a n is m st o r e d u cet h ed 锄a g em e ch a n is mo fca r d io m y o cy t e su n d e rs t r e s s H o w e V e r ，m a n y m e ch 肌is m sh a v en o ty e tb e e ncla r if ie d A1 0 to fs t u d ie sh a V es

14、h o w nt h a th ig h e x p r e s s io n o fS ir t l p r o t cininr e n a l a n de h o n d r o c”e sca nr e d u cet h ep m d u ct io no fm a r k e r so f e n i【o p la s m ic r e t icu lu mi坞u r yinr a t s liV e r ，in d ica t in gm a tS ir t Ica nr e g u la t et h es t r e s s r e s p o n s eo fe n d

15、o p la S m ic r e t icu lu m ，a n d 、V h e t h e rS ir t l isr e g u la t e db ye n d o p la s m ic r e t icu l啪ins e p t ics h o ckr a t sm o d e la n dt 1 1 ep r o t e ct iV ee f f e cto nca r d io m y o cy t e sis 如r t h e rco n f im e d I nt h iss t u d y ，w eu s e din t r a V e n o u si哂e ct io

16、 no flip o p o iy s a cch a r id e ( L P S ) t om d k em o d e lo fs e p t ics h o ckt oo b s e r v et h ee 蔬cto fr e s v e r a t r o lo nca r d ia cf u n ct io na n d it sp r o t e ct iV em e ch a n is m M e t h o d ：T h ir cy t w om a leW is t a rr a t sw e r er a n d o m lyd iV id e din t of o u

17、rg r o u p s ：b la n k co n t r 0 1g r o u p ( C o n 野o u p ) ，s e p t ics h o ckg r o u p ( L P Sg r o u p ) ，r e s V e r a t r o lg r o u p ( R S V g r o u p ) ，d e x a m e t h a s o n eg r o u p ( D X MG r o u p ) w a s u s e dt om o n it o rt h eb lo o dp r e s s u r ea n d le Rv e n t r icu la

18、rf u n ct io ninr a t s T h es e p s iss h o ckm o d e lw a se s t a b lis h e db yin t r a V e n o u s in j e ct io no fL P S T h eb lo o dp r e s s u r ew a s30 lo w e r t h a nt h eb a s e lin eV a lu e T h eco n t r o l g r o u p a 1 1 dt h e s e p s isg r o u p 岫e ctp h y s io lo g ica l s a li

19、n e ，t h e r e s V e r a t r o Ig r o u pa n d d e x 锄e t h a S o n eg r o u p埘e ctco r r e s p o n d in gd r u g ，t h es e m ma n dm y o ca r d iu mw e r e 中国医科大学硕士学位论文 co lle ct e da R e r4h o u r s T h e no b s e et h em o 印h o lo g ica l ch a n g e so fm y o ca r d iu m a 1 1 dt e x t t h ee x p

20、 r e s s io no fs e m min f la m m a t o 呵m e d ia t o r sa n dt h ee x p r e s s io no fS I R T1a n d G R P 7 8p r o t e ina r ldm I t N A e x p r e s s io n1 e V e lsinm y o ca r d iu mt is s u e R e s u lt s ： C O m p a r e dw it hC o n 订o lg r o u p ，t h e ca r d ia cf h n ct io no fL P Sg r O u

21、 p d e cr e a s e d ，t h ed 锄a g eo fm y o ca r d ia lce llsw a ss ig n m ca I lt lyin cr e a s e d ，a n dt h es e r u I I l T N F 一0 【le v e lw a sin cr e a s e d ( P O 0 5 ) C o m p a r e dw it hL P Sg r o u p ，t h eh e a nr a t eo fR S V g r o u pa n dD X M 黟o u pd e cr e a s e d ( P 0 0 5 ) ，a n

22、 dt h e r ew a sn os ig n m ca n td i疵r e n ce b e t w e e nt h et w og r o u p s T h ep r o t e ine x p r e s s io na n dm R N Ae x p r e s s io no fS ir t l inR S V g r o u pa I ldD X Mg r o u pw e r ein cr e a s e d ，t h ee x p r e s s io n1 e V e l o fG R P 7 8p r o t e ina I ld m R N Ae X p r e

23、 s s io nW e r ed e cr e a S e d ( P 0 0 5 ) ， T h eco n t e mo fG R P 7 8inR S Vg r o u p d e cr e a S e ds ig n if ica n t ly ( P O 0 5 ) C o n clu s io n ：R e s v e r a t r o lp r o t e ct sa g a in s tm y o ca r d ia lin j u r yins e p t ics h o ckr a t sb y in h ib it in ge n d o p la s m ic r

24、e t icu l姗 s t r e s s r e s p o n s e ， a 1 1 dt h ee 行e ctisb e t t e rt h a n d e x 锄e t h a s o n e K e yw o r d s ：s e p t ic s h o ck ；r e s v e r a 0 1 ；e n d o p la s m ic r e t icu lu ms t r e s s ；ca r d ia c m n ct io n ；m y o ca r d ia lin j u 叫 V 中国医科大学硕士学位论文 英文缩略语 S I R S s y s t e m i

25、cin f la m m a t o r yr e s p o n s es y n d r o m e 全身炎症反应综合征 M O D S m u lt ip leo r g a lld y s 劬ct io ns y n d r o m e 多器官功能障碍综合症 U C P u 1 1 co u p lin gp r o t e in 解偶联蛋白 E R Se n d o p la s m icr e t icu lu ms t r e s s 内质网应激 G R P 7 8 g lllco s er e g u la t e d p r o t e in 7 8 葡萄糖调节蛋白7 8 H

26、 s p 7 0 h e a ts h o ckp r o t e in s 热休克蛋白7 0 S in ls ile min f o 加a t io nr e g u la t o r 沉默信息调节因子1 D M S Od im e m y l“f o x id e二甲基亚砜 E L I S A e n z y m e1 in k e dim m u n o s o r b e n ta s s a y 酶联免疫吸附测定 R E S r e s v e r a t r 0 1自藜芦醇 L P S lip o p 0 1 y s a cch a r id e 内毒素 U P R u n f o

27、 ld e dp r o t e inr e s p o n s e 未折叠蛋白 H R h e a r tr a t e 心率 B Pb lo o dp r e s s u r e 斑压 T N F 一旺t 哪o rn e cr o s isf a ct o r u 肿瘤坏死因子一a V 中国医科大学硕士学位论文 目录 摘：要 I A b s t r a ct I I I 英文缩略语 v 白藜芦醇对脓毒症休克大鼠心功能的保护作用及机制 l前言 1 2 材料与方法 4 2 】材料 4 2 1 1 主要仪器 4 2 1 2 主要试剂 4 2 1 3 实验动物 5 2 2 方法 5 2 2 1 大

28、鼠脓毒症休克模型的建立方法 5 2 2 2 左心室功能测定的方法 6 2 2 3 血压监测的方法 6 2 2 4 实验用液的配制 6 2 2 5 动物分组 7 2 2 6 留取标本 7 2 2 7 心肌组织病理形态学观察 8 2 2 8 免疫组化 8 2 2 9 酶联免疫吸附测定( E L I s A ) 8 2 2 1 0 蛋白免疫印迹分析( W e s t e r nB lo t ) 9 2 2 1 lR e a l T im eP C R 1 0 2 2 1 2 统计学分析 1 2 3 结果 1 3 3 1 白藜芦醇对大鼠心功能的影响 1 3 3 2 心肌组织形态学观察 1 3 中国医科

29、大学硕士学位论文 3 3 免疫组化实验结果 1 4 3 4 酶联免疫吸附测定T N F a 结果 1 6 3 5 蛋白免疫印迹实验结果 1 7 3 6 R e a 卜T im eP C R 实验结果 1 8 5 结 念 2 2 本论文创新性的自我评价 2 3 参考文献 2 4 文献综述 2 8 攻读学位期问取得的研究成果 3 6 致谢 3 7 个人简历 3 8 中国医科大学硕士学位论文 白藜芦醇对脓毒症休克大鼠心功能的保护作用及机制 l前言 脓毒症( s e p s is ) 是由感染引起宿主反应失调进而导致危及生命的器官功能 障碍，为感染、烧伤、严重创伤、外科大手术、中毒及心肺复苏后常见的并

30、发症， 可使患者体内促炎反应和抗炎反应平衡失调、内环境紊乱、凝血功能紊乱等，甚至 导致脓毒性休克( s e p t ics h o ck ) 、多器官功能障碍综合症( M O D S ) 及死亡，从本 质上来讲，脓毒症是机体对感染因素的反应，由于其病情进展迅速、病死率高，一 旦发生，会给临床救治工作带来很大困难I 。 最新版的脓毒症和脓毒症休克管理指南中指出，在脓毒症发病初期进行早期 液体复苏、抗生素治疗及血管活性药物的应用可以明显改善预后，对于上述治疗仍 不能维持血流动力学稳定的患者可给予糖皮质激素治疗，指南中虽未将糖皮质激素 作为常规推荐用药，但大量研究表明【2 圳，小剂量糖皮质激素不仅可

31、以减轻脓毒症时 的心肌细胞损伤并改善心功能，对脓毒症引起的急性肾衰竭及急性肺损伤也有不同 程度的保护作用。 脓毒症休克常伴随全身各器官功能损伤，其中以心肌损伤最为常见且病死率较高， 在脓毒症休克早起即可出现心肌细胞结构的改变、心肌细胞水肿甚至心脏舒缩功能 障碍1 5 】，近些年来，对脓毒症心肌损伤的机制研究越来越受到重视，主要有：m iR N A s 失调激活相关炎症信号通路，使促炎因子I I ，一6 、T N F a 等分泌增多，抗炎因子I L 一1 0 等分泌减少；解偶联蛋白( u n co u p lin gp r o L e in ，U C P ) 增加线粒体呼吸链的解偶 联作用，使氧

32、化磷酸化过程减慢甚至进入空转状态，阻碍了三磷酸腺昔( A T P ) 的 正常产生；髓样细胞表达激发受体一1 ( T R E M 一1 ) 促进促炎因子的合成，从而加重全 身炎症反应；内质网应激( e n d O p a s m icr e t icu lu ms t r e s s ，E R S ) 和凋亡信号的激 活引起心肌细胞凋亡；微血管循环功能障碍、心肌缺血缺氧引起心肌损伤，其中心 肌细胞凋亡是心肌损伤的重要发病机制 6 ，凋亡( a p o p t o s is ) 是活体内局部组织中 单个细胞程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dce lld e a t h )

33、的表现形式，是由体内外因 素促发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动性死亡方式，内质网在细胞凋亡中 起到重要作用，与内质网应激相关。 内质网应激是指当细胞受到缺氧、感染的刺激后，破坏了内质网腔内的正常 中国医科大学硕士学位论文 氧化环境，导致ca 2 + 代谢异常，内质网的功能发生紊乱的现象，其主要表现为内质 网腔内错误折叠蛋白与未折叠蛋白结合及钙离子平衡紊乱，从而激活凋亡通路等信 号途径对心肌细胞产生损伤，内质网应激直接地影响应激细胞的转归。葡萄糖调节 蛋白7 8 ( g lu co s er e g u la t e dp r o t e in 7 8 ，G R P 7 8 ) 作为一种分

34、子伴侣在蛋白质折叠 和转运过程、维持内质网稳定及内质网应激反应中起到重要作用，是内质网应激反 应的特异性标志物之一，作为热休克蛋白7 0 ( H s p 7 0 ) 家族的同源基因，G R P 7 8 在 线粒体受到低糖、低氧、低C a 2 + 等刺激产生内质网应激时转移并纠正内质网内错误 折叠的蛋白质，从而保证细胞在应激状态下蛋白质充分合成【7 d 1 1 。 哺乳动物沉默信息调节因子l( S ir t l) 是酵母S ir 2 ( s ile n tin f o r m a t io n r e g u la t o r 2 ) 同源性最高的同源基因，是依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸( N A

35、D + ) 的 第1 I I 类组蛋白去乙酰化酶，在能量调节、代谢、衰老、凋亡等过程中起到重要作用。 在心肌细胞中，s ir t l通过去乙酰化相关因子增强细胞抵抗氧化应激的能力、调节 细胞能量代谢、减少细胞凋亡、减轻全身炎症反应、调节心脏的舒缩功能等，S ir t l 在胎儿及成人各器官组织中广泛表达( 大多数细胞在细胞核中表达) ，以心脏、脑 组织、骨骼肌中分布较多，在肺脏、肝脏、肾脏、及卵巢等组织中亦存在2 。1 5 J 。S ir t l 通过核浆穿梭机制参与细胞分化或细胞凋亡，心肌细胞中S ir t l的过表达通过F o x 0 1 依赖途径保护心肌细胞对氧化应激反应的损伤并增加F

36、o x 0 3 和F o x 0 4 活性，通过 去乙酰化P 5 3 蛋白的第3 8 2 位赖氨酸及N F k B 的亚基减少其介导的细胞凋亡及炎症 反应。大量研究表明，S ir t l在各种心脏疾病、前列腺疾病、糖尿病肾病、脑血管 疾病、恶性肿瘤、烧伤、神经退行性疾病中均起到不同程度的保护作用6 。2 0 】。 白藜芦醇( R e s v e r a t r 0 1 ) 是一种在葡萄、花生、桑树等植物中存在的非黄酮类多 酚化合物，分子量为2 2 8 2 5 ，具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗炎症等生物 学特性，并且是至今为止发现的最好的S ir t l特异性激活剂，能增加s I R T

37、l在脑、 心、肾、肌肉及脂肪组织中的表达并具有延长酵母、线虫及果蝇寿命的功能【2 1 1 2 3 J ， 且在一定计量范围内对人体无毒害及副作用，西方许多国家在食品、保健以及医药 等领域均有广泛应用，而国内则罕见报道。大量研究证实，白藜芦醇可通过上调 s ir t l对大鼠心肌缺血再灌注损伤、脓毒症大鼠心肌损伤、脓毒症大鼠急性肺损伤 起到保护作用。 s ir t l对减轻心肌细胞在应激状态下的损伤机制研究广泛，但还有很多机制 尚未明确。有研究表明在大鼠肝脏、肾脏及软骨细胞中增加s ir t l蛋白表达可以减 少内质网损伤标志物的产生，说明S ir t l可以调节内质网应激反应，而在脓毒症 中国

38、医科大学硕士学位论文 休克大鼠模型中S ir t l是否通过调节内质网应激对心肌细胞产生保护作用有待进 一步证实。 根据以上研究背景，我们推测自藜芦醇对脓毒性休克大鼠的心肌损伤具有保 护作用，其机制可能与内质网应激反应有关。为进一步证实，本实验通过静脉注射 L P S 的方法建立脓毒性休克大鼠模型，并观察白藜芦醇对脓毒性休克大鼠心脏组织 形态、血清中炎症因子水平、左心室功能、心肌组织中内质网应激反应标志蛋白、 s I R T l表达的影响，期望通过本研究可以为脓毒性休克的临床治疗提供更多的参考。 中国医科大学硕士学位论文 2 1 主要试剂和仪器 2 材料和方法 2 1 1 主要试剂 白藜芦醇(

39、 美国S I G M A ) S I R T l一抗( 美国S I G M A ) G R P 7 8 一抗( 美国S I G M A ) 蛋白M A R K E R ( T h e r m o ) E C L 发光液( T h e r m o ) S D S P A G E 凝胶配制试剂盒( 碧云天) R I P A 裂解液( 碧云天) P M S F ( 碧云天) s D s P A G E 蛋白上样缓冲液( 5 x ) ( 碧云天) B C A 蛋白浓度测定试剂盒( 增强型) ( 碧云天) 二抗( 兔子) ( 中杉金桥) 二抗( 鼠) ( 中杉金桥) 即用型免疫组化( 鼠兔) ( m a

40、 ix in B io ) R N A is oP lu s ( T A K A R A ) R N a s e f r e eW a t e r ( T A K A R A ) 反转录试剂盒( T A K A R A ) S Y B R ( T A K A R A ) 弓I 物合成( T A K A R A ) D A B 显色液( 中杉金桥) 2 1 2 主要仪器 台式高速冷冻离心机( T h e r m oS cie n t if icF o 硼a ) 电泳仪( 上海天能公司) 生物显微镜( N ik o n 公司) 磁力搅拌器( 上海龙跃仪器设备有限公司) 水平摇床( 海门市其林贝尔公

41、司) 封口机( 温州兴业机械) 4 中国医科大学硕士学位论文 梯度P C R 仪( 伯乐B io R a d 公司) 生物组织包埋机+ 冷台( L e ica ) 石蜡切片机( 美康公司) 摊片机( L e ica ) 烤片机( L e ica ) 生物显微镜( N ik o n ) 荧光定量P C R 仪( 罗氏R o ch e 公司) 多功能酶标仪( B io T e k 公司) 纯水机( 上海康雷分析仪器有限公司) 化学发光成像分析系统( 美国A z u r e ) 水平摇床( 海门市其林贝尔公司) 超声波破碎仪( 美国S o n ics 公司) 雪花制冰机( 北京长流科学仪器有限公司)

42、 掌中宝离心机( 北京天根生物科技公司) 电热恒温培养箱( 天津泰斯特公司) 2 1 3 实验动物 清洁级雄性w is t a r 大鼠3 2 只，体重( 2 0 0 2 5 0 ) g ，由辽宁长生生物技术有限 公司提供， 动物许可证号s C X K ( 辽) 2 0 1 5 0 0 0 1 。在中国医科大学附属盛京医院 动物实验中心适应性喂养1 周，大鼠饲料及饮水均由该实验中心提供，1 2 小时昼夜 交替，控制室温在2 3 2 ，屏障系统内气压为正压，空气清洁度7 级，保持环境 的清洁，自由摄食及饮水，实验前剔除毛色不光泽，活动欠佳的大鼠。 2 2 研究对象和分组 2 2 1 大鼠脓毒症休

43、克模型的建立方法 通过静脉注射L P S 方法建立大鼠脓毒症休克模型【2 4 】，具体方法如下：采用腹腔 注射2 0 乌拉坦麻醉大鼠后，仰卧位固定于鼠板，腹股沟部备皮，碘伏消毒腹股沟 部皮肤，在该处作一长约卜2 cm 的切口，用止血钳小心分离肌肉及深部筋膜，清晰 地暴露出股三角区，股三角区上界为鼠蹊韧带，内界为缝匠肌，外界为内收长肌。 股动、静脉及神经由此三角区通过，股神经位于外侧，股动脉位于中间偏后，股静 脉位于内侧。仔细暴露长约lcJ ll的股静脉，静脉下方穿两根线备用，结扎远心端， 中国医科大学硕士学位论文 用连接有注射器的套管针向近心端穿刺并固定。向股静脉缓慢注射L P S 溶液 (

44、2 0 m g 垤) ，待血压较基础值下降3 0 视为造模成功【2 4 】。 2 2 2 左室内压及心功能测定的方法 采用右颈动脉插管方法进行左室功能监测，具体方法如下：首先大鼠称重，腹 腔注射2 0 乌拉坦进行麻醉后将大鼠仰卧位固定于鼠板，剪去颈部气管偏右侧的鼠 毛，大约卜2 cm ，用碘伏消毒3 遍，剪开颈部皮肤，用镊子仔细分离颈部肌肉及筋 膜，充分暴露颈动脉约lcm ，注意快速分离迷走神经，避免过多刺激，轻轻挑起颈 动脉并在其下方备两根细线，结扎远心端，近心端用动脉夹夹闭( 时间不可过长) ， 靠近细线结扎处近心端方向剪出一个小口，将连接在八导多功能记录仪( 泰能 B L 一4 2 0

45、L ) 的动脉导管( 管内充满肝素溶液) 从缺口处向近心端送入，松开动脉夹， 打开三通及换能器，边观察电脑中的波形变化边将导管缓慢推进导管，当波形振幅 高大、波宽较宽、舒张压在O 附近，提示导管进入左心室，固定导管，缓慢推入少 量肝素盐水防止堵管，待波形稳定后通过生理信号采集处理系统记录大鼠左室舒张 末压( L 、，E D P ) 、收缩期左室内压上升最大速率( + d p d t r I la X ) 、舒张期左室内压下降 最大速率( d p d t I r K ) 等相关指标。 2 2 3 血压监测的方法 采用股动脉穿刺进行大鼠血压监测，具体方法基本与股静脉穿刺相同，但应注 意股动脉较细，

46、包被筋膜层数较多且不易分离，实验时动作应轻柔仔细，避免反复 穿刺引起失血甚至动脉血管断裂，若失血较多则不应将该大鼠纳入实验，以免对实 验结果造成影响。 2 2 4 实验用液的配制 4 多聚甲醛：称4 9 多聚甲醛固体溶于1 0 0 m lP B s 中，烤箱( 7 0 ) 一夜配制成4 多聚甲醛溶液。 充管用肝素：2 m l肝素钠溶液加入到2 4 8 m l生理盐水中。 2 0 乌拉坦溶液：2 0 9 固体加入到1 0 0 m l生理盐水中。 L P S 溶液：5 0 m g 的L P S 粉末溶于1 0 m l生理盐水中。 P B S ：N a C l 9 9 N a 2 P 0 4 2 H

47、 2 0O 4 9) 加蒸馏水至5 0 0 0 m 1 N a 2 P 0 4 1 2 H 2 06 9 中国医科大学硕士学位论文 电泳缓冲液： 转膜缓冲液： T r is S D S 甘氨酸 T r is 甘氨酸 甲醇 4 预冷后使用 3 0 3 9 lg 1 4 4 9 3 0 3 9 1 4 4 9 2 0 0 m l 2 4 2 9 8 9 1 m l 1 2 1 9 4 0 9 5 m 1 ) 加蒸馏水至1 0 0 0 m 1 ) 加蒸馏水至lO o o m l 加蒸馏水至1 0 0 0 m l 加蒸馏水至5 0 0 m 1 封闭液( 5 脱脂奶粉) ：5 9 脱脂奶粉溶解于lO O m lT B S T 中。 白藜芦醇溶液：需用含二甲基亚砜( D M