白细胞介素34诱导白细胞介素17的产生加重胶原诱导关节炎小鼠关节炎的研究

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1、 1 llrlr lllrJIlir llllJ lll 1 lllr J iiiiirlr llJ 1 1 矿3 2 6 8 2 3 7 分娄号： 1 _ ) 5 7 3 ” 密蛹：坌翌 单位代码 学号 缒中回錾种太零 1 0 1 5 9 2 0 1 4 2 0 17 5 硕士学位论文 中文题目：白细胞介素3 4 诱旱白细胞介素1 7 的产生加重胶原诱 导关节炙小鼠关节炎的研究 英文题目：I L 一3 4 a g g r a w it e s a r t h r it isinC I Ai t f ice b yin d u cin g 【L 一1 7 p r u d u ct io n 论

2、文作者 指导教师 学科专业 完成时间 张丽 ；圮晖教授 内科学 2 0 1 7 年3 月 中国医科大学硕士学位论文 白细胞介素3 4 诱导白细胞介素1 7 的产生加重胶原 诱导关节炎小鼠关节炎的研究 I L 3 4a g g r a v a t e sa r t h r it isinC I Am iceb yin d u cin gI L 一17 p r o d u ct io n 论文作者 张丽指导教师选生堂 申请学位匡鲎塑培养单位一箜二鳖盎堂堕 一级学科鳖盎匡堂 二级学科虫銎堂 研究方向基堡垒瘗 论文起止时间2 Q 3 曼生曼旦= 2 Q ! Z 主2 旦 论文完成时间 2 Q 】Z 生

3、兰旦 中国医科大学( 辽宁) 2 0 17 年3 月 I llf lllllI I II I I lllllllI I I II llJ J Y 3 2 6 8 2 3 7 中国医科大学学位论文独创性声明 本人郑重声明：本论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作 及取得的研究成果，论文中除加以标注的内容外，不包含其他人或机构 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过 的成果。对本研究提供贡献的其他个人和集体均己在文中进行了明确的 说明并表示谢意。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 了 函 日期： 沙 年石月2 日 中国医科大学学位论文版权使用授权

4、书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的原件、复印件和电 子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国医科大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密() ，在 年后解密适用本授权书。( 保密：请在括号内 划“ ) 论文作者签名：1 钿 日期：2 刀f7 年6 月2 日 指导教师签名：争 日期： 加，7 年石月日 中国医科大学硕士论文 摘要 目的：类风湿关节炎( r h e u m a t o ida r t h r it is ，R A ) 是

5、一种慢性系统性自身免疫性疾 病，但其发病机制至今仍不明确。白细胞介素3 4 ( in t e r le u k in 3 4 ，I L 一3 4 ) 是一种新 发现的细胞因子，我们的前期研究发现I L 3 4 在R A 患者血清和滑膜液中水平显著升高， 但其在R A 发病中具体作用机制不清楚。此研究拟通过对R A 动物模型胶原诱导的关 节炎( co lla g e nin d u ce da r t h r it is ，C I A ) 小鼠的研究，初步探索I L 3 4 参与R A 发病的作 用机制：研究I L 3 4 与促炎因子肿瘤坏死因子c【( t u m o rn e cr o s i

6、sf a ct o r - 0 【，T N F 一0 【) ， 白细胞介素1 7 ( in t e r le u k in 1 7 ，I L 1 7 ) 和白细胞介素6 ( in t e r le u k in 一6 ，I L - 6 ) 的相互作 用，来探讨I L - 3 4 在R A 发病中的具体作用机制。 研究方法：本研究建立C I A d 、鼠模型并且腹腔注射外源性重组鼠( r e co m b in a t io n m o u s e ，r m ) I L 一3 4 。根据小鼠关节红斑，肿胀及关节强直进行关节炎指数评分。酶 联免疫法( e n z y m elin k e dim

7、m u n o s o r b e n ta s s a y ，E L I S A ) 检澳E C I A d , 鼠外周血血清中 T N F - n ，I L 1 7 和I L 6 的浓度。反转录P C R ( r e v e r s et r a n s cr ip t ：io n - P C R , R T - P C R ) 的方 法检澳g C I A d 鼠滑膜组织中T N F 1 2 ，I L 1 7 乖 I L 6 的m R N A 的表达水平。 结果：注射r r n lL 3 4 加重C I A d x 鼠发病，增加关节炎指数评分。阻断I L 一1 7 后减 轻C I A J

8、x 鼠发病，且关节炎指数评分低于磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds o lu t io n ， P B S ) 处理的C lA d 鼠。向C I A 模型鼠腹腔内同时注射r m lL 一3 4 和抗I L 一1 7 抗体，小鼠 关节炎指数评分较单独注射r m lL 一3 4 的C I A 模型鼠降低。I L 3 4 显著增加外周血中 T N F q ，I L 一1 7 和I L 6 的分泌，阻断内源性I L 1 7 后，T N F 一1 2 和I L 6 的分泌下降。向C I A 模型鼠腹腔内同时注射r m I L 一3 4 和抗I L 1 7

9、抗体，与单独注射r m lL 一3 4 的C I A 模型鼠相 比较，血清中T N F 1 2 ，I L 1 7 和I L 6 的浓度显著下降。I L 3 4 显著增加滑膜组织中 T N F 一理和I L 1 7m R N A 表达，阻断内源性I L 1 7 后，T N F 一和I L 1 7m R N A 的表达下降。 同时注射r m lL 3 4 和抗I L 1 7 抗体，与单独注射r m lL 一3 4 的C I A 模型鼠相比较，滑膜中 T N F - a 和I L 1 7 m R N A 水平显著下降，I L 一6 m R N A 表达水平无显著差异。 结论：I L 3 4 促进C

10、I A 的发病是通过I L 1 7 的表达发挥作用的，从而为R A 的治疗提 供新思路和新靶点。 关键词：类风湿关节炎；I I 型胶原诱导关节炎小鼠：白细胞介素3 4 ；白细胞介 素1 7 ； 课题资助：国家自然科学基金( N o 8 1 3 7 3 2 1 9 ) 。 中国医科大学硕士论文 A b s t r a ct O b j e ct iv e ：R h e u m a t o idA r t h r it is ) isach r o n ics y m m e t r ica l a u t o im m u n ed is e a s e T h e p a t h o g e

11、n e s iso fR A iss t ill iln k n o w r t I n t e r le u k in - 3 4 ( I L - 3 4 ) isan e wcy t o k in e O u r p r e v io u ss t u d ys h o w e dt h a tt h es e r llma n ds y n o v ia l f lu idle v e lso fI L 一3 4inR Ap a t ie n t s w e r es ig n if ica n t lyin cr e a s e d ，b u tt h ep a t h o g e n

12、 e s iso fI L 一3 4inR Aisn o tcle a r I nt h is s t u d y , w ee x p lo r e d t h em e ch a n is mo f e x o g e n o u s I L - 3 4o nR Aa n im a lm o d e l - co lla g e n - in d u ce da r t h r it is ( C I A ) ，d e t e ct e dt h er e la t io n s h ipb e t w e e n I L - 3 4a n do t h e r p m in t la m

13、 m a t o r ycy t o k in e s ，t u m o rn e cr o s isf a ct o r - a ( T N F - 0 【) ，in t e r le u k in ( I L ) 一17 ，a n d in t e r le u k in ( I L ) 一6 ，s p e cu la t e dt h ek e y r o leo f - 3 4int h ep a t h o g e n e s iso f R A M e t h o d s ：W ee s t a b lis h e daC I Am o u s em o d e la n din

14、j e ct e de x o g e n o u sr e co m b in a t io n m o u s eI n t e r le u k in - 3 4 ( r m lL 一3 4 ) in t r a p e r it o n e a lly T h ea r t icu la rin d e x ( A I ) w a sm e a s u r e d a cco r d in gt ot h ea m o u n to fe r y t h e m a ，s w e llin g ，o rj o in tr ig id it y T h eco n ce n t r a

15、t io n so f T N F 一，I L 一17a n dI L 6inC I Am ices e r aw e r em e a s u r e db ye n z y m e - lin k e dim m u n o a s s a y ( E L I S A ) T h em R N Ae x p r e s s io nle v e lso fT N F 一0 【，I L 一17 ，a n dI L - 6inC I As y n o v ia l t is s u e w e r ed e t e ct e db yr e v e r s et r a n s cr ip t

16、 io nP C R ( R T - P C R ) R e s u lt s ：O T h em iced o s e dw it hr m I L 3 4a g g r a v a t e dt h ein cid e n ceo fC I Aa n din cr e a s e d a r t icu la rin d e x ( A I ) I nt h eC I Am icet r e a t e dw it ha n t i I L - 17a n t ib o d yina d v a n ce ，t h e a r t h r it iss co r e sw e r elo

17、w e rt h a nt h o s eo fC I Am ice I nt h eC I Am icein j e ct e dw it h r m lL 一3 4a n da n t i I L 一17a n t ib o d y , t h eA 1w a slo w e rt h a nt h a tinr m lL 一3 4 - t r e a t e dm ice T h eco n ce n t r a t io n so fT N F - 仪，I L 一17 ，a n dI L 一6ins e r u t ninC I A + I L 一3 4m icew e r e in

18、cr e a s e dco m p a r e dt ot h o s einC I Am ice S e r u mT N F - 0 l，I L 一17 sa n dI L - 61 e v e ls in C I A + a n t i- I L 一17m icew e r ed e cr e a s e ds ig n if ica n t lyco m p a r e dw it ht h o s einC I Am ice C o m p a r e d 晰mC I A + r m lL 一3 4 ，T h eco n ce n t r a t io no fT N F a ，I

19、 L 一17 ，a n dI L 一6ing r o u p C I A + r m lL 3 4 + a n t i I L 1 7W a ss ig n if ica n t lyd e clin e d I h ee x p r e s s io no f T N F - aa n dI L - 1 7 m R N AinC I A + I L 一3 4m ices y n o v ia lt is s u e sw e r ein cr e a s e d , b u tt h e r ew a sn os ig n if ica n te f f e cto n t h ee x p

20、 r e s s io no f 石m R N A W it hn e u t r a liz a t io no fe n d o g e n o u sI L 一17 ，t h ele v e lso f T N F 一0 【a n dI L 17m R N Ad e clin e d C o m p a r e dw it hC I A + r m lL - 3 4 T h ee x p r e s s io no f T N F - 0 【a n dI L 一1 7m R N Aing r o u pC I A + r m lL 一3 4 + a n t i- I L - 1 7W a

21、 ss ig n if ica n t lyd e clin e d ， b u tt h e r ew a sn os ig n if ica n te f f e cto nt h ee x p r e s s io no f I L - 6r n R N A C o n clu s io n ：I L - 3 4p r o m o t e st h ed e v e lo p m e n to fC I At h r o u g ht h ee x p r e s s io no fI L - 1 7 U 中国医科大学硕士论文 T h ism a yp r o v id e san e

22、wt r e a t m e n tt a r g e to fR A K e y w o r d s ： R h e u m a t o id a r t h r it is ； C o lla g e n - in d u ce d a r t h r it is ；I n t e f le u k in - 3 4 ； I n t e r le u k in 17 I I I 中国医科大学硕士论文 一 一 英文缩略语 一 一 英文缩写 一蔓奎全整 主塞全签 一 _ _ _ _ _ 一一 R A R h e u m a t o ida r t h r it is类风湿关节炎 C I A A

23、 I P B S m R N A cD N A R T P C R T h l7 T N F 一伐 C F A E L I S A I F A C S F 1 R M C S F I L R A N K L P B M C s C o lla g e n - in d u ce da r t h r it is A r t h r it icin d e x P h o s P h a t eb u f f e r e ds a lin e M e s s e n g e rr ib o n u e le iea cid C o m p le m e llt a r yD N A R e v

24、e r s et r a n s e r ip t io n P o ly lle r a s ech a in r e a e t io T h e lp t y p e1 7 T u m o rn e cr o s isf a ct o r q C o m p le t eF r e u n d Sa d j u v a n t E n z y m elin k e dim m u n o s o r b e n t a s s a y I n co m p le t eF r e u n d Sa d j u v a n t C o lo n y s t im u la t in g f

25、 a ct o r1 r e ce p t o r M a cr o p h a g e - co lo n ys t im u la t in g f a ct o r I n t e r le u k in R e ce p t o ra ct iv a t o ro fn u cle a r f a ct o rr 3 3lig a n d P e r ip h e r a l b lo o dm o n o n u cle a r ce l】S 胶原诱导关节炎 关节炎指数 磷酸盐缓冲液 信使核糖核酸 互补脱氧核糖核酸 逆转录 多聚酶链反应 辅助性1 7 肿瘤坏死因子 完全弗氏佐剂 酶联

26、免疫吸附检测 不完全弗氏佐剂 集落刺激因子1 受体 巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素 核因子r 3 3 受体激动子配 体 外周血单核细胞 R F R h e u m a t o idf a ct o r 类风湿因子 M M P 3 坚型兰旦! 型! 竺里竺塑呈呈! ! ：! 茎垦垒星璧鱼堕!一 _ _ _ 一。 I V 中国医科大学硕士论文 目录 摘要 I A b s t r a ct I I 英文缩略语 I V 白细胞介素3 4 诱导白细胞介素1 7 的产生加重胶原诱导关节炎小鼠关节炎的研究 1 前言 1 2 材料和方法 3 2 1 主要试剂和仪器 3 2 1 1 主要试剂 3 2 1 2

27、主要仪器 3 2 1 3 主要试剂配制 4 2 2 实验方法 4 2 2 1 实验动物及分组 4 2 2 2C I A 模型的建立 4 2 2 3 给药方法 4 ，2 2 4 酶联免疫吸附法检测血清中T N F Q ，I L 1 7 和I L 一6 的表达 5 2 2 5R T P C R 检测滑膜组织中T N F 0 【，I L 1 7 和I L 6 m R N A 表达水平 5 2 2 6 统计分析 7 3 结果 8 3 1I L 3 4 加重胶原诱导关节炎小鼠关节炎程度，加重小鼠关节炎指数评分 8 3 2 血清中I L 3 4 与抗I L 1 7 抗体对T N F a ，I L 一1 7

28、 和I L 6 的浓度的影响 8 3 - 3R T - P C R 方法评估滑膜组织中促炎因子T N F 电, I L - 1 7 和I I A r n R N A 的表达 9 4 讨 仑 11 5 结 念 1 3 本研究创新性的自我评价 ，1 4 参考文献 1 5 综述 1 7 V 中国医科大学硕士论文 攻读学位期间取得的研究成果 2 6 致谢 2 7 个人简历 2 8 V I 中国医科大学硕士论文 论文：白细胞介素3 4 诱导白细胞介素17 的产生加重胶 原诱导关节炎小鼠关节炎的研究 1 前言 类风湿关节炎( r h e u m a t o ida r t h r it is ，R A )

29、 是一种慢性系统性自身免疫性疾病， 其病理特点是多关节的滑膜炎改变。主要对称性侵及手、足等小关节。常伴有关节 外器官受累及自身抗体的产生。可导致关节畸形和关节功能丧失，严重影响患者的 生活质量。R A 的发病可能与遗传、感染、性激素等多种因素有关。目前认为环境 和基因因素之间相互影响，共同作用于机体导致R A 的发病【l叫。但具体发病机制尚 不明确。胶原诱导小鼠关节炎模型( co lla g e n in d u ce da r t h r it is ，C I A ) 由于其病理改 变与人关节炎相似，是目前公认的用于研究人关节炎的理想模型【4 5 J 。 白细胞介素3 4 ( in t e

30、r le u k in 3 4 ，I L 一3 4 ) 是2 0 0 8 年由L in 和同事在研究蛋白质组 学过程中新发现的细胞因子。人I L 3 4m R N A 在多种组织中表达，包括心、肝、脾、 肺、脑、胸腺、小肠、结肠、卵巢、睾丸、前列腺等，而在脾脏表达水平最高。通 过免疫组织化学方法检测到I L 一3 4 蛋白质在脾红髓内皮表达，这与它调节骨髓细胞 的生长和分化的作用相一致【6 】。目前，对于这种新型细胞因子的了解很少，在发现 1 1 3 4 的同时也发现了它与巨噬细胞集落刺激因子( m a cr o p h a g e - co lo n ys t im u la t in g

31、f a ct o r ，M C S F ) 共用同一受体一集落刺激因子1 受体( co lo n y s t im u la t in g f a ct o r1 r e ce p t o r ，C S F 一1 R ) 【6 1 。I L - 3 4 和M C S F 实际上有结构相关性，而I L 一3 4 和M C S F 无氨基酸序列同源性，两者的结合位点不同，且信号激活路径和生物学活性也不尽 相刚1 1 。I L 一3 4 与C S F 1 R 结合促进吞噬细胞( 如巨噬细胞、破骨细胞和朗格汉斯细 胞) 的增殖、生存和分化 8 母2 0 。我们前期研究发现R A 患者血清与滑膜中I L

32、 一3 4 的 浓度升高，并且与类风湿因子( r h e u m a t o idf a ct o r s ，R F ) ，抗环瓜氨酸肽抗体 ( a n t icy cliccit r u llin a t e dp e p t id ea n t ib o d y ，C C P ) 及疾病活动度呈正相关 1 0 - 1 1J 。有研 究报道I L 3 4 水平与关节炎的严重程度相关 1 2 1 。但是，I L 3 4 在R A 发病中的具体作 用机制尚不明确。 目前认为白细胞介素1 7 ( in t e r le u k in 1 7 ，I L 1 7 ) 是R A 发病中的一个重要细胞 因

33、子【1 3 。我们前期研究显示：I L 一3 4 可促进R A 患者外周血单核细胞分泌I L 一1 7 【1 0 1 。 中国医科大学硕士论文 因此，我们推断I L 一3 4 通过调节T h l7 细胞介导R A 发病。本研究通过研究外源性 I L 一3 4 对C I A 小鼠发病的影响，推测I L 一3 4 与促炎因子肿瘤坏死因子a ( t u m o r n e cr o s is f a ct o r ，T N F 一) ，I L 一1 7 和I L 一6 之间的关系，从而探讨I L 一3 4 在R A 发病中的作用及 其机制。 2 中国医科大学硕士论文 2 1 主要试剂和仪器 2 材料

34、和方法 2 1 1 主要试剂 牛I I 型胶原( C I I ) ( 美国S ig m a 公司) 完全弗氏佐齐O ( C F A ) ( 美 S ig m a 公) 不完全弗氏佐剂( I F A l( 美国S ig m a 公司) 乙酸( 国药集团化学试剂有限公司) 鼠I L 1 7 I L - 1 7 A 抗体( M A B 4 2 1 ) ( 美国R & D 公司) 重组鼠I L - 3 4 ( 5 1 9 5 一M L 0 1 0 ) ( 美国R & D 公司) 鼠I L 一1 7 试剂盒( D Y 4 2 1 ) ( 美国R & D 公司) 鼠I L 6 试剂盒( D Y 4 0 6

35、 ) ( 美国R & D 公司) 鼠T N F 一试剂盒( D Y 4 1 0 ) ( 美国R & D 公司) 磷酸盐缓冲液( P B S ) ( 美国H y e lo n e 公司) R T P C R 试剂盒( 中国索莱宝生物技术) T r iz o l试剂( 天津灏洋生物公司) 异丙醇( 国药集团化学试剂有限公司) 三氯甲烷( 国药集团化学试剂有限公司) 琼脂糖( 西班牙B io w e s t 公司) 2 1 2 主要仪器 超低温冰箱( 美国F o r m a 公司) 低温高速离心机( 美国B e e k m a nC o u lt e r 公司) 紫外分光光度计( 美国T h e r

36、 m o 公司) 普通冰箱( 青岛海尔股份有限公司) 酶标仪( 美国B io t e e h 公司) 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) P C R 仪 凝胶成像分析仪( 美国T h e r m o 公司) 中国医科大学硕士论文 2 1 3 主要试剂配制 3 乙酸：3 m l纯乙酸加入1 0 0 0 m l蒸馏水中 I I 型胶原：lm gI I 型胶原溶于0 5 m l3 o 乙酸于4 冰箱中过夜 C F A ：已于4 。C 冰箱中过夜的I I 型胶原于C F A 等体积冰浴混合，注射器反复抽吸充 分乳化。 I F A ：已于4 。C 冰箱中过夜的I I 型胶原于I F A 等体积冰浴混

37、合，注射器反复抽吸充分 乳化。 鼠I L 一1 7 I L 一1 7 A 抗体和重组鼠I L 一3 4 按说明书进行稀释 2 2 实验方法 2 2 1 实验动物及分组 实验动物：D B A 1 雄性小鼠( 8 1 0 周龄) 实验分组：空白对照组 C I A 模型组 C I A + I L 3 4 组 C I A + a n t i I L 一17 组 C I A + a n t i I L 一17 + I L 一3 4 组 4 只 4 只 4 只 4 只 4 只 2 2 2C I A 模型的建立 D B A 小鼠适应性喂养一周后( 给予充足的水和食物，更换干净舒适的垫料) 开 始初次免疫：浓

38、度2m g m l的牛I I 型胶原与完全弗氏佐剂等体积混合后于小鼠尾 根部皮下注射，每只小鼠注射1 0 0 微升混合物。2 1 天后进行激发免疫，浓度2m g m l 的牛I I 型胶原与不完全弗氏佐剂等体积混合后于小鼠尾根部皮下注射，每只小鼠 注射1 0 0 微升混合物。第2 5 天开始，小鼠关节逐渐出现红斑、肿胀和强直。当关 节炎指数评分( A I ) 4 ，外踝体积 1 6 时，即视为造模成功。 关节炎指数评分标准O 3 分：0 = 正常关节；1 = 关节轻度肿胀，伴或不伴红疹， 无关节的畸形和缺损；2 = 关节重度肿胀，无关节的畸形和缺损；3 = 存在关节畸形、 缺损或强直。对每只小

39、鼠的每只爪进行关节炎指数评分，关节炎指数评分为4 只爪 评分总和，每只鼠最高关节炎指数评分1 2 分。 2 2 3 给药方法 4 中国医科大学硕士论文 1 和组：第2 5 、2 7 、2 9 、3 1 天腹腔注射7 5 微克抗I L 1 7 抗体( I L - 1 7 I L 一1 7 A ， M A B 4 2 1 ) 。 2 和组：第2 4 天开始腹腔注射外源性r m lL 一3 4 ( 5 1 9 5 一M L 一0 1 0 ) ，每只小鼠 2 微克连续注射7 天。 3 和组：在相同时间点腹腔注射等体积的磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e d s

40、 a lin e ，P B S ) 2 。2 4 酶联免疫吸附法( e n z y m elin k e dim m u n o s o r b e n ta s s a y ，E L I S A ) 检测血清中 T N F 位，I L 一1 7 番1 1 I L 6 的浓度 收集外周血，转速2 5 0 0r m in 离心1 0 分钟，获取血清，根据E L I S A 试剂盒说 明书步骤检测T N F 0 【，I L 1 7 和I L 一6 浓度。 酶标板准备工作： 每孑L 板加1 0 0 微升用P B S 稀释的C a p t u r e A n t ib o d y , 盖膜室温孵育一晚

41、； 抽出每板液体，用W a s h B u f f e r 洗3 次( 每孔加入约4 0 0 微升) ，每次尽量倒 干净洗液，最后一次洗完后，吸出液体并将板反转于滤纸上吸干洗液； 每孔加入3 0 0 微升R e a g e n tD ilu e n t ，室温下孵育至少1 小时； 洗板3 次； 分析步骤： 每孔加入1 0 0 微升样品( 样品可用R e a g e n tD ilu e n t 稀释) ，盖膜室温孵育2 小时： 洗板3 次； 每孔加入1 0 0 微升D e t e ct io n A n t ib o d y ，盖膜室温孵育1 小时； 洗板3 次： 每孔加入1 0 0 微升S

42、t r e p t a v id in H R P ，盖膜室温孵育2 0 分钟，避光： 洗板3 次； 每孔加10 0 微升S u b s t r a t eS o lu t io n ，室温培育2 0 分钟，避光； 每孑L 加5 0 微升S t o pS o lu t io n ，轻敲孔板以确保混匀； 酶标仪4 5 0 n m 处检测光密度值。 2 2 5 反转录P C R ( r e v e r s et r a n s cr ip t io nP C R ，R T P C R ) 检测滑膜组织中T N F G t ，I L 1 7 F O I L 。6 m R N A 表达水平 提取总R

43、N A 中国医科大学硕士论文 称取滑膜组织重量 将称取的组织剪碎 于液氮中研磨成粉末状，加1 毫升T r iz o l，待溶解后，将匀浆吸入E P 管中 离心：4 摄氏度，1 4 0 0 0 转，1 5 分钟 取上清，加入新的E P 管中，各N 2 0 0 微升氯仿，剧烈震荡1 5 秒钟，待充分乳化 后再室温静置5 分钟 离心：4 摄氏度，1 4 0 0 0 转，1 5 分钟 取上清5 0 0 微升，加入等体积( 5 0 0 微升) 异丙醇，上下颠倒离心管，充分混匀 后，在1 5 3 0 摄氏度下静置1 0 分钟 离心：4 摄氏度，1 4 0 0 0 转，1 5 分钟 倒掉液体，留沉淀，倒扣于

44、滤纸上吸干 各加入1 毫升7 5 乙醇，将沉淀弹起，静置1 5 分钟 离心：4 摄氏度，1 4 0 0 0 转，1 5 分钟 倒掉乙醇，尽量吸干净，不存留乙醇，室温放置5 1 0 分钟 各加入3 0 微升D E P C 水 测0 D 值 通过R N A 变性，逆转录反应合成R N A O P C R 反应：9 4 。C 反应2m in ，( 9 4 。C 反应3 0S ，5 5 。C 反应3 0S ，7 2 。C 反应3 0s ) 3 0 个循环，最后，7 2 反应5m in 。 凝胶电泳，凝胶成像分析系统分析。 引物序列如表1 。 表1 引物序列表 6 中国医科大学硕士论文 2 2 6 统计

45、分析 计量资料的多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用L S D 方法，以 上均使用软件S P S S l6 0 进行分析。P 值小于0 0 5 有统计学意义。结果均用均值 标准差表示。 7 中国医科大学硕士论文 3 结果 3 1I L 3 4 ，J f l重C I A d x 鼠关节炎程度及小鼠关节炎指数评分，阻断I L 1 7 下调I L 一3 4 的作用 为明确外源性I L 3 4 对C 认鼠的影响，我们向D B A l鼠腹腔内注射外源性重组 鼠I L 3 4 ( R & D ) 并观察小鼠爪子的红肿程度。每2 天评估每只小鼠关节炎指数。实验 最后，处死小鼠，分离膝关节和踝关节。

46、如图3 1 所示：从第2 8 天开始，C I A 模型 小鼠的关节炎指数评分逐渐增加。用抗几1 7 抗体中和C I A 小鼠内源性I L 1 7 ，小 鼠关节炎指数评分低于磷酸盐缓冲液处理的C 认小鼠，但仍高于正常对照组。腹腔 注射外源性重组鼠I L 3 4 的C I A 小鼠，关节炎指数评分显著高于未注射I L 3 4 的C 队 模型小鼠。向C I A 模型鼠腹腔内同时注射外源性I L 3 4 和抗I L 1 7 抗体，小鼠关节 炎指数评分较单独注射外源性几3 4 的C I A 模型鼠降低。由此我们得出：I L 3 4 可 能通过诱导I L - 1 7 的产生在类风湿关节炎发病中发挥作用。 a4 _ 1 21 6 柏2 I 柏3 2 黄柏4 4 柏5 2 弱 D a y sa f t e rp r im a r yim m u n iz a t io nco il C o n t r o I 4 - C lA + a n t iI L 1 7 + r m I L 一3 4 一a n t i I L 1 7 + r m lL 一3 4 图3 1 不J 司组小鼠关节炎指数评分。 箭头显示开始腹腔注射外源性几 3 4 ( 2 p g ) 连1 周，第2 5 开始，