新疆塔克拉玛干7株沙漠藻的分子鉴定及生物学特性研究

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1、分类号：分类号：密密 级：级： 学号：学号：107622014210516107622014210516单位代码：单位代码：1076210762 新疆师范大学新疆师范大学 20172017 届硕士学位论文届硕士学位论文 新疆塔克拉玛干新疆塔克拉玛干 7 株沙漠藻的株沙漠藻的分子分子鉴定及生物学特性研究鉴定及生物学特性研究 Identification and Biological Characteristics of SevenAlgae in Taklimakan Desert of Xinjiang 研究生姓名研究生姓名 ：卡丽比努尔卡丽比努尔艾依提艾依提 学科、专业学科、专业 ：微生物学

2、：微生物学 研究方向研究方向：应用微生物应用微生物 院系、年级院系、年级 ：生命科学学院生命科学学院 、20142014 级级 指导教师指导教师：努尔古丽努尔古丽热合曼（副教授）热合曼（副教授） 新疆师范大学新疆师范大学 20172017 年年5 5 月月 2727 日日 I 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：日期：年月日 关于

3、论文使用授权的说明关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解新疆师范大学有关保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属新疆师范 大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分 内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后遵守此规定） 保密论文注释：本学位论文属于保密在年解密后适用本授权 书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 本人签名：日期： 导师签名：日期： II 摘要 本研究从新疆塔克拉玛干沙漠分离纯化的

4、4 株绿藻和 3 株蓝藻进行形态观察、 分子生物学鉴定法来鉴定沙漠藻的遗传位置，探讨沙漠藻的生长周期并外界因素对 藻类生长的影响分析藻种的最佳生长条件。通过高效液相色谱法和普通 PCR 基因检 测法，分析沙漠藻藻毒素 MC-LR 和藻毒素合成酶基因 mcyE 基因并对新疆塔克拉玛 干沙漠藻类分子生物学研究和藻类食品应用方面提供理论依据。 首次，通过光学显微镜和扫描电镜观察从塔克拉玛干沙漠分离出来的 7 株藻类 中 3YS16的是绿色、粘稠、油性，细胞较小，椭圆形藻； KXII(2)是黄色、干燥、 难挑取，细胞偏大，球状藻；3YS21-1 是绿色，油性，球状藻；YS2-3 是偏黄色、干 燥、难挑

5、取、近球状藻。蓝藻 BYS14-1、YS3-1 和 JP4-1 是念状藻。 其次，采用分子生物学方法 18S rRNA 和 16S rRNA 基因序列分析结果表明：沙 漠绿藻 3YS16和 3YS21-1 的测序序列与GenBank上的Chlamydomonas incerta相似 率是 99%。YS2-3 的测序序列与 Chlorosarcinopsis communis 相似率是 97%。KXII(2) 测序序列与 Chlorosarcinopsis bastropiensis 相似率是 99%。 沙漠蓝藻 BYS14-1 的测序 序列与 Aphanizomenon aphanizomen

6、oides（丝囊藻）相似率是 98%，YS3-1 是与 Leptolyngbya sp（鞘丝藻）相似率是 99%，JP4-1 的测序序列与 GenBank 已知序列同 源性低，相似率 95%。 再次，绘制出 7 株沙漠藻的生长曲线并外界因素对藻类生长的影响结果表明，4 株绿藻培养第 3 天开始进入对数生长期；3 株蓝藻里面 BYS14-1 第 2 天进入对数生 长期；YS3-1 第 3 天进入对数生长期；JP4-1 在第 11 天进入对数生长期。7 株沙漠藻 在培养的一月没没有进入衰亡期。3YS16的最适生长的 pH 值为 6.0，温度为 40， 光强度为 2500 Lux； 3YS21-1

7、的最适生长的 pH 值为 5.0， 温度为 40， 光强度为 2500 Lux；KXII(2) 的最适生长的 pH 值为 8.0，温度为 35，光强度为 4500 Lux；YS2-3 的最适生长的 pH 值为 8.0，温度为 30，光强度为 2500 Lux；BYS14-1 的最适生长 的 pH 值为 5.0， 温度为 30， 光强度为 3500 Lux； YS3-1 的最适生长的 pH 值为 5.0， 温度为 30，光强度为 2500 Lux；JP4-1 的最适生长的 pH 值为 6.0，温度为 40， 光强度为 4500 Lux。 最后，通过高效液相色谱法（HPLC）和普通 PCR 基因检

8、测法检测微囊藻毒素 MC-LR 和藻毒素合成酶 mcyE 基因，HPLC 实验结果表明微囊藻毒素标准品保留时 间为 17.8 min ，但 7 株沙漠藻此处没有保留。微囊藻毒素 mcyE 基因检测结果表明 mcyE 基因引物没有扩增出来 7 株沙漠藻 E 基因序列， 可知这 7 株藻没有控制产生藻 毒素的合成酶基因，说明 7 株藻不产生藻毒素。通过普通 PCR 检测 mcyE 基因的实 验结果跟高效液相色谱法检测微囊藻毒素 MC-LR 的结果一致。 说明从塔克拉玛干沙 漠分离纯化的这些藻不产生藻毒素。 III 关键词：关键词：塔克拉玛干沙漠；沙漠藻；分子鉴定；藻毒素；外界因素 Abstract

9、 The study isolated 4 strains green algae and 3 strains cyanobacteria from Xinjiang Taklimakan desert to identify genetic position by morphological and molecular biological method, to investigate the growth cycle and effects of temperature, light intensity and pH value on the growth of desert algae.

10、 analysis MC-LR and microcystin synthetase mcyE gene of desert algae by method of high performance liquid chromatography and detection gene , to provide a theoretical basis for molecular biology and application of algae foods of Xinjiang Taklimakan desert algae. First, The 3YS16 is divided into oval

11、 algae by optical microscope and electron microscop, 3YS21-1、YS2-3 、KXII (2) into spherical algae;3YS16 is green, thick, oily, small cells and oval algae; KXII (2) is yellow, dry, hard to pick, cells are relatively large, spherical algae; 3YS21-1 is green, oily, spherical algae; YS2-3 is yellow, dry

12、, hard to pick, nearly spherical algae. BYS14-1、YS3-1 and JP4-1is Nostoc. Secondly, Molecular biology methods18S rRNA and 16S rRNA gene sequence analysisdemonstratedthatstrains3YS16 and3YS21-1wereidentified Chlamydomonas incerta. strain YS2-3 were identified Chlorosarcinopsis communis.strain KXII(2)

13、 were identified Chlorosarcinopsis bastropiensi. Strain BYS14-1 were identified Anabaena. Strain YS3-1 were identified Leptolyngbya sp. low homology of sequencing JP4-1 with known GenBank sequence and similarity rate is 95%, so may be JP4-1 is new genus. Again, draw out seven strains of desert algae

14、 growth curve and study the effects of external factors on the desert algae. The results showed that 4 strains of algae of the third day entered the logarithmic growth phase. cyanobacteria of BYS14-1 second days into the logarithmic growth phase; YS3-1 third days into the logarithmic growth phase; J

15、P4-1on the ninth day after entered the logarithmic period,seven desert algae did not enter the decline phase . Desert algae 3YS16 suitable pH vales is the acidic environment ,and the optimum pH was 6.0, temperature is 40,light intensity is 2500 Lux ;3YS21-1 suitable pH was 5.0, temperature is 40,lig

16、ht intensity is 2500 Lux; KXII(2) optimum pH was 8.0, temperature is 35, light intensity is 4500 Lux ;YS2-3 optimum pH was 8.0, temperature is 30, light intensity is 2500 Lux; BYS14-1 optimum pH was 5.0, temperature is 30, light intensity is 3500 Lux; YS3-1 optimum pH was 5.0, temperature is 30, lig

17、ht intensity is 3500 Lux; JP4-1 optimum pH was6.0, temperature is 40, light intensity is IV 4500 Lux. Finally, by high performance liquid chromatography (HPLC) and PCR gene detection method for microcystin MC-LR and microcystin synthetase gene mcyE, HPLC results showed that microcystin standard rete

18、ntion time is 17.8min, but 7 strains desert algae without reservation.The PCR gene detection results showed that primers did not amplified the E gene sequences. The results showed that these 7 strains of desert algae have not microcystin synthetase gene, indicating that the 7 strains of algae did no

19、t produce algal toxins. The results were consistent with the results of high performance liquid chromatograpHy for detection of microcystin MC-LR. The results showed that the algae isolated from the Taklimakan Desert did not produce algal toxins. Key Words： Taklimakan Desert, Desert algae, Molecular

20、 identification, Microcystins; external factors V 目 录 1 前言.1 1.1 藻类简介.1 1.1.1 藻类生长环境.2 1.2 沙漠藻类.2 1.2.1 沙漠藻类生态分布.3 1.2.2 沙漠藻的国内外研究状况.3 1.3 藻类的应用.4 1.4 藻毒素简介.5 1.4.1 微囊藻毒素(MC)研究状况.6 1.4.3 微囊藻毒素的危害.8 1.4.4 微囊藻毒素的检测.8 1.5 研究目的及内容.9 2 塔克拉玛干沙漠藻的纯化与分子鉴定.10 2.1 实验材料.10 2.2 实验方法.10 2.2.1 藻种的培养与分离.10 2.2.2 光

21、学显微镜观察.11 2.2.3 扫描电镜观察.11 2.2.4 藻株生长曲线的绘制.11 2.2.5 基因组 DNA 的提取. 11 2.2.6 序列扩增与测序.11 2.2.7 系统发育树分析.11 2.3 实验结果.11 2.3.1 沙漠藻的形态特征.12 2.3.2 藻类的生长曲线.14 2.3.3 18S rRNA 基因序列的 PCR 扩增.16 2.3.4 16S rRNA 基因序列的 PCR 扩增. 20 2.4 讨论.20 3 环境因素对塔克拉玛干沙漠藻生长的影响.22 3.1 实验材料.22 3.2 试验方法.22 3.2.1 pH 对沙漠藻生长的影响.22 VI 3.2.2

22、温度对沙漠藻生长的影响.22 3.2.3 光强对沙漠藻生长的影响.23 3.3 实验结果.23 3.3.1 pH 对沙漠藻生长的影响.23 3.3.2 温度对沙漠藻生长的影响.24 3.3.3 光强度对沙漠藻生长的影响.25 3.4 讨论.26 4 塔克拉玛干沙漠藻微囊藻毒素的检测.28 4.1 实验材料.28 4.2 试验方法.28 4.2.1 高效液相色谱法.28 4.2.2 藻毒素合成酶 mcy-E 基因的检测. 29 4.3 实验结果.29 4.3.1 高效液相色谱检测结果.29 4.3.2 藻毒素合成酶基因 mcy-E 基因的 PCR 检测结果.34 4.4 讨论.34 全文总结.3

23、6 展望.38 参考文献.39 在读期间发表的论文.44 后记.45 1 前言 第 1 页 共 45 页 1 前言 1.1 藻类简介 藻类是一个生物群体，地球上最早出现的绿色自养生物，在 35 亿年前的前寒武 纪就已经出现，在以后长达 10 亿年的时间里，它们几乎统治了整个地球表面。虽然 历经了 35 亿多年的沧桑巨变，但到目前为止，藻类仍然是地球上分布最广，高度多 样的，地球上最古老的，生存最成功的生物类群之一。仅在生态系统中占据重要地 位，而且在进化关系上跨越原核和真核两界，拥有特殊的进化地位，因此其系统进 化研究一直是生物学家关注的热点1。 藻类形态多种多样，大小悬殊，一般肉眼不能看到，

24、但微囊藻大量繁殖时，其 群体可达 1500m，悬浮于水柱中肉眼可见。藻类没有真正的根、茎、叶的分化，具 有叶绿素，能够进行光合作用，把水中的无机物合成蛋白质、脂类、糖类及其他化 合物，是水生生态系统食物链的基础2。藻类通常呈单细胞、丝状体或片状体，结构 简单，整个生物体都能进行光合作用，具有光合效率高、生长周期短、速度快的特 点。 藻类按大小通常分为大藻（海带、紫菜、裙带菜等）和微藻(单细胞或丝状体， 直径小于 1mm)。微藻种类繁多，分布极其广泛3其生长几乎不需要特别营养成分 ， 只要有阳光、水和二氧化碳，无论在海洋、淡水湖泊等水域、或在潮湿的土壤、树 干等处都能生存、也可在不适合种植庄稼的

25、土地上种植，甚至可生长在咸水里。藻 类可进行营养繁殖（透过细胞分裂或断裂） 、无性繁殖（透过释出游动孢子或其他孢 子）或有性繁殖。有性繁殖通常发生于生活史中的艰难时期（如于生长季节结束时 或处于不利的环境条件下） 。 藻类在现代分类系统中都没有一个合适的位置，但仍被广泛地使用；一般而言， 藻类是一群具有叶绿素，营自养生活，植物体没有真正的根茎叶的分化，生殖器官 为单细胞的，用单细胞的抱子或合子进行生殖的低等植物。按曾呈奎的分类系统藻 类分为 12 个门，即蓝藻门、红藻门、隐藻门、甲藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、 裸藻门、褐藻门、原绿藻门、绿藻门、轮藻门。除此以外，还有很多小的门类，如 绿胞藻，

26、灰胞藻(仅一个种)4。地球上 99%的生物空间由水构成，因此藻类有足够的 生存空间，也有足够的时间来进化，蓝藻经历了很长的地质时代 33.5 亿年，而高等 植物只有 4 亿年，可以想象藻类物种是何其丰富。地球上到底已发现多少种藻类， 由于文献整理和分类系统不同等多方面的原因，不同的专家看法不一:WiIson 认为已 发现 26900 种藻类和 4760 种细菌和蓝藻(中国科学院生物多样性委员会)4；而据 Corliss 作的详细调查，世界上己正式报道的纯藻类有 40650 种，原生动物和藻类兼 性(如裸藻 Euglena 等)有 10493 种5。事实上由于藻类个体小，大多需要通过显微镜 观察

27、，许多藻类至今仍未被发现。藻类分类学家一致认为：未被描述的种类可能超 1 前言 第 2 页 共 45 页 过己被描述的种类。 1.1.1 藻类生长环境 藻类在地球上的分布极广，几乎在有光和潮湿的任何地方，从炎热的赤道地区 到千年冰封的极地，从零下数十度的南北极到高达 85的温泉，无论在江河湖海、 沟渠塘堰等各种水体中，还是在潮湿的土表、墙壁、树干、树叶、岩石上甚至沙漠 中，都有其生长，都能见到藻类的踪影。此外它们还可以与其他生物营共生生活； 人们熟知的地衣(Lihcen)就是菌类和藻类的共生体；还有少数藻类的生境更为奇特， 如生长在满江红属(Azolla)子里的满江红鱼腥藻(Anabaena

28、azolla)、 生在兽类的皮毛上 如龟背上的龟背基枝藻(Basicladia chelounm)，以及内生于鱼类、甲壳动物等水生动 物体内的藻类6。蓝藻(blue-green algae)是地球上最早出现的光合自养原核生物，广 泛分布于湖泊、水库、河口等水域。正常的水体生态环境中蓝藻的数目维持在正常 的范围内。 1.2 沙漠藻类 土壤是研究陆生藻的最好生境，耕地、林地、草原、荒漠、寒漠等多种土壤生 境已被广泛研究。荒漠藻类是指生长在荒漠地区的土壤藻类，是陆生藻类中特定的 生态学类群，而非藻类分类学上的概念。荒漠藻类能在干旱、营养贫瘩、强辐射等 环境恶劣条件下生存和繁衍，并通过自身的生理生态作

29、用，影响和改变荒漠环境。 荒漠藻类作为荒漠、半荒漠生态系统的先行者，在荒漠土壤的保水、改良、防风固 沙及全球气候变化方而都有明显的生态功能。荒漠地区雨水少，降水不均，土壤贫 瘠， 它们代表着土壤藻的生态极端7。 荒漠藻出现后， 先在沙表形成光滑平坦的结皮， 并随土壤含水量的增加而扩展，经过长时间的风蚀、雨蚀后，转变成粗糙的、参差 不齐的、不规则型结皮，因此荒漠藻对土壤的最大贡献莫过于使沙面固定，降低侵 蚀。 在荒漠最常见的优势种主要是蓝藻， 如微鞘藻(Microcoleus)， 伪枝藻(Scytonema)， 裂须藻(Schizothrix)， 念珠藻，织线藻，鼓球藻(Desmococcus)

30、和裂丝藻(Stichococcus)8 等。 荒漠藻类作为干旱半干旱生态系统的先行者，对荒漠土壤的形成起了关键的作 用， 荒漠藻类是荒漠生物结皮中重要组成部分， 因此这类结皮也叫藻类结皮或藻壳9。 藻类结皮在荒漠、半荒漠地区的土壤演替中扮演着非常重要的角色，在防止土壤侵 蚀方面有着显著的效果，也是固沙的最主要的标志之一10。藻类结皮的出现，可以 在荒漠、半荒漠地区的植物组成群落间形成 78%的覆盖率，这种结皮组成较为复杂， 有较强的抗逆性，生理生态过程特殊，但对于荒漠土壤的固定、水分的保持、近地 面层冷热状况、全球气候变化等方面都存在着重要作用10。 1 前言 第 3 页 共 45 页 1.2

31、.1 沙漠藻类生态分布 沙漠被认为是生命的禁区，藻类在这类环境中的生存，不仅依赖于它们对各种 胁迫的生理适应，同时也与它们占据极端环境中较有利的生态位有关。Dvaey 等11 报道南极陆生藻结皮有精细结构，即表面为非生命物质构成的无机层，低层为以 pHormdiuimu autmnal 召为主的藻丝体、其他是蓝藻、真核藻、菌类、苔鲜及线虫等 的主要分布区，最底层为死的有机物分布区。因此不同质地的土壤中有着不同的群 落组成， 如粘土、 沙土中有硅藻， 砂土、 壤土中有绿藻， 几乎所有土壤中有蓝藻12-13， 藻类多样性和生物量主要受光照、温度、可得性水及土壤理化性质的影响14。荒漠 藻类的生态分

32、布是由多种因子共同作用的。土壤理化特性、通气状况、营养、温度、 pH 值和氧一还电势以及土壤生物间的相互作用等都是影响荒漠藻类分布的重要因 子。例如，土壤 pH 与荒漠藻的分布有关，中性和碱性土壤有助于蓝藻的分布，而在 酸性环境中，绿藻则占优势。土壤质地、结构和持水量是影响荒漠藻群落分布的重 要因素。在质地较细的荒漠土壤上分布的蓝藻种类较多，良好的土壤通气状况和含 水量高的土壤环境有利于荒漠藻抱子的萌发、生长和发育。此外，季节变动和气候 变化对荒漠藻类的分布具有一定的作用。光照强度和光周期对荒漠藻类的分布也有 影响。在干旱的荒漠环境中风力则是影响荒漠藻类分布的重要限制因子15。 1.2.2 沙

33、漠藻的国内外研究状况 许多研究者已研究了生物结皮的藻类组成、结皮形成的特点和功能 (AliAnantaniDurrell Fletcher and Marthin,1948; Forese Ashley HawkesHawkes绿藻则以单细胞种类和球形种类为主;硅藻以脆杆藻属、 舟形藻属和菱板藻属植物为主(胡春香等，2003)。腾格里沙漠东南缘的沙坡头荒漠结 皮中，蓝藻不论种类数还是生物量都占绝对优势17。刘永定，胡春香多次研究表明， 我国荒漠地区的生物结皮中以蓝藻门、绿藻门、硅藻门、裸藻门为主，这些类群中， 蓝藻占优势，而蓝藻又以丝状种类为主;绿藻中以球状种类居多，裸藻数量最少。(胡 春香等，2003;张丙昌等，2005)。 1.3 藻类的应用 绿藻是一类营养丰富的完全食物，细胞富含蛋白质、酶、维生素、矿物质，还 有叶绿素。含有维生素 B1、B2、B6、B12、C、E、K 及件胡罗卜素、生物素、胆碱、 必需脂肪酸、叶酸、肌醇、落碱酸、泛酸等；其有助于肠道功能正常运作，并刺激 有益菌生长繁殖和调节胆固醇；同时亦可改进免疫功能，有很强的抗病毒、抗肿瘤 活性，并能修护