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Sp17单克隆抗体及其阿霉素免疫偶联物靶向治疗卵巢癌的实验研究

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Sp17 单克隆抗体 及其 阿霉素 免疫 偶联物 靶向 治疗 卵巢癌 实验 研究
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摘要 摘要 人精子蛋白 17 (sperm protei n 17, Spl7) 是高度保守的睾丸组织特异性蛋白,近年 来研究发现其在某些妇科肿瘤组织 ,特别是卵巢癌组织 中特异性 高表达 ,是潜在的卵巢 癌靶 向治疗 的靶 点。近年 来 ,随着 生物技 术在 医学领域 的快速 发展和 从分子水平对发病 机制 的认识 ,单克隆抗体 药物 己成 为恶性肿瘤靶 向治疗领 域的研 究热点 。然而 ,目前 尚 未有利用 Spl7 单克隆抗体治疗肿瘤的研究。本课题拟在前期工作的基础上,利用高表 达 Spl7 的肿瘤细胞和动物模型,一方面考察 Spl7 单克隆抗体 3C 12 (IgG 1单抗)的体 内外抗肿瘤活性 ,并探讨其作用机制 ;一方面 以 3C 12 为靶 向载体 ,将“ 弹头” 药物-阿霉 素与抗体偶联, 形成 3C 12-D O X 抗体药物免疫偶联物 ( A nti body-D rug Conjugate, A D C ), 在确保其抗体免疫活性不受影 响的前提下 ,考察其体 内外抗肿瘤活性 ,靶 向性和毒副作 用 ,为研制 高效低毒 ,特 异性 强 的抗 卵巢癌抗体靶 向药物奠 定研 究基础 。 具体 内容如下 : 1.抗 Spl7 单克隆抗体体外抗肿瘤研究 在课题组前期工作的基础上,利用能分泌 Spl7 单克隆抗体 ( 3C 12) 的杂交瘤细胞 株 制 备大量单抗 ,考 察其 体 外 抗 卵 巢癌作用 。 本研究用 E LISA 的方法测定抗体效价;选择 SK 0 V 3、H 0 8910 和 C 0 C 2 三种卵巢 癌细胞为工具细胞, 并通过免疫印迹法和免疫荧光法考察三种细胞中 Spl7 的表达情况; 利用 M TT 法检测 3C 12 对三种细胞的直接毒性作用; 利用 Cyto Tox 96 非放射性细胞毒 性检测试剂盒考察 3C 12 的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 ( A D C C ) 和补体依赖的 细 胞 毒作 用 ( C D C )。 结果显示: 制备的 Spl7 单克隆抗体 3C 12 (亚型鉴定为 IgG !单抗) 具有较高的效价。 在三种卵巢癌细胞中,SK 0 V 3 细胞异常高表达 Spl7, H 0 8910 中等表达 Spl7, CO C2 细 胞低表达 Spl7; 细胞 ELISA 结果显示 3C 12 单抗与靶细胞结合力强弱与 Spl7 蛋白的表 达量呈正有关, 并呈浓度依赖性; M TT 法检测发现, 不同浓度的3C 12 单抗 ( 10 4、10 10_ 2、10人 1 和 10| ag/m L ) 对以上三种卵巢癌细胞均没有明显的细胞毒作用,说明 3C 12 单抗没有引发细胞内的凋亡通路,或者细胞表面 Spl7 对于肿瘤细胞的生长没有决定性 摘 要 作用 。 为了进 一步探 讨 3C 12 的体 外抗 卵巢癌活性 与初 步 的机 制 , 对 3C 12 单抗进行 A D C C 和 C D C 效应 的检 测 ,发现3C 12 单 抗通 过 A D C C 和 C D C 作用 后对 SK 0 V 3 细 胞产 生 了 一 定的抑制作用 ,其 最 高抑 制 率分 别约 为 32% 和 50% ; 说 明效 应 因子 ( 外 周血 单个 核细 胞或补体 )可 以提 高 3C 12 单 抗对 肿瘤 细胞 的杀伤 作用 。 2. Spl7 免疫偶联物的体内外抗肿瘤活性研究 虽然 3C 12 在体 外 可 以通 过 效 应 因子抑制肿 瘤 细胞 的生长 ,但其 效果 不甚 理想 。本 论 文进 一步 利用 3C 12 作 为载 体 ,将其 与化 疗药物 -阿霉 素 ( D O X ) 偶 联 ,考察 其体 内外 的抗肿 瘤 活 性 。 体 外实验发现 ,3C 12-D O X 偶 联物作 用 48 和 72 h 时对 SK O V 3 和 H 0 89 10 细 胞活 力有 明显的抑制 作 用 ,且对 SK O V 3 细胞 的抑制 作 用强 于 H 0 89 10 细 胞 ,而对 C O C 2 细 胞的活力基本无影响,说明 3C 12-D O X 偶联物的细胞毒作用基于细胞中 Spl7 的表达量 的多少 , 进一步证 实 了 3C 12-D O X 的靶 向作用 。 流 式细胞术 结果也发现在体外 3C 12-D O X 免疫偶 联物可 以诱导 SK O V 3 细胞 和 H 0 8910 细胞 发生凋亡 。 在体 内实验 中, 利 用 SK O V 3 细 胞成 功制 备 了荷 瘤 裸 鼠;在 给予 连 续五周尾 静 脉 注射 3C 12-D O X 免疫 偶联 物 ( 每周 一 次 )后发现 ,3C 12-D O X 明显抑 制 实体瘤 的生长 ,促进肿瘤 细胞凋亡 ;相对于单独注射 D O X 组 ,3C 12-D O X 组 的 毒性 较 低 ,更 加 安全 。 综上,本研究从细胞和整体动物水平探讨 了以 Spl7 为靶点的单克隆抗体 ( 3C 12) 及其免疫偶联物 ( 3C 12-D O X )的抗卵巢癌活性, 发现在效应因子的作用下 3C 12 对 Spl7+ 的细胞具有明显 的杀伤 作用 ;尤其是 3C 12-D O X 偶联物 ,其在体 内外均具有 明显抑制肿 瘤的作用,且其安全性优于单独使用化疗药物 ( 阿霉素 )。该结果为以 Spl7 为靶点的 肿瘤 靶 向治疗提 供 了有 力 的 实验 依据 ,为进 一 步 开 发 卵巢癌 肿瘤 靶 向药物 奠 定 了理 论基 础 。 关键 字:精子蛋 白17 、单克隆抗体3C 12、3C 12-D O X 偶联物 、靶 向治疗 、卵巢癌 II A b stra c t A b s tra c t Spl7 is a sperm atozoa-specific protein w hi ch is over expressed in m ul ti pl e types of tum or, especially in gynecological cancers (ovarian, endom etrial and cervical cancers) but is absent or expressed at low levels in m ost norm al tissues. T he function of Sp l7 is poorly understood, and it is thought to be involved i n acrosom al reaction during fertilization, cell -cell i nteracti ons, and cell m igration. W i th the rapid developm ent of biotechnology in the m edical field and the know ledge of pathogenesis from the m olecular level, m onoclonal anti body drugs has becom e one of hot topics of cancer targeted therapy. H ow ever, the experim ental studies on the m onoclonal antibody of Sp l7 (3C 12, IgG j) for cancer have not been reported. O ur previous studies show ed that 3C 12 targeted and accum ulated in Spl7 positive tum ors in vivo, w hich prom pted its capability for cancer target therapy. Thus, based on our previous w ork, w e exam i ned the antitum or effect, the target activi ty and the side eff ects of 3C 12 and a novel im m unoconjugate containing 3C 12 linked to a chem otherapeutic agent doxorubicin agai nst ovarian cancer cell lines and tum or m odels in vitro or in vivo. T his study w ill set up the foundation for researching and developing antibody target drug for cancer w ith high eff icient and low toxicity, and provide a new approach and theoretical foundation for therapy of Sp l7 postive tum or. The results are show n as below : 1. Stu dies on th e anti-tu m or effects of anti -S p l7 m A b 3C 12 in vitro In the first part of this paper, based on the previous w orks, anti-Spl7 m A b (3C 12) w as prepared, purified and tested the titer by usi ng the E LISA . O ur researches i nvestigated the degree of Sp l 7 protein expression i n three kinds of ovarian cancer cells by W estern bl ot and im m unofluorescence analyses, detected the di rectly toxici ty of 3C 12 to those ovarian cancer cells. T hen, w e exam ined the A D C C and C D C by using the C ytoTox 96 N on-R adioactive C ytotoxi cit y A ssay. W e found the m onoclonal antibody of Sp l7 (3C 12, IgG i ) had the titer of 106, and i nt ense Spl7 expressi on i n SK OV 3 cel ls and rel ati vel y l ow er expressi on i n H 0 8910 cells, w hereas li t tle Sp l7 expression in C O C cells. 3C 12 had signifi cant higher bi nding to SK O V 3 or H 0 8910 cells, and had li ttle binding to C O C 2 cells. T he binding of 3C 12 to SK O V 3 or H 0 8910 w as concentration-dependently. There w as no di rect cytotoxici ty and signifi cant difference i n viabili ty of SK O V 3, H 0 8910, and C O C 2 cells treated w i th 3C 12 and in A b strac t nonspeci fic negative control antibody from the concentration of 0. 000 1- 10 f xg/m L at any tim e poi nt tested. The resul ts indicated that 3C 12 did not ini tiate the intracellular pathw ays of apoptosis, or Sp l7 expressed on cell surface w as not a decisive role for tum or cell grow th. T o further discuss the antitum or effect and prel im i nary m echanism of 3C 12, w e exam ined the cytotoxi c action of 3C 12 m ediated by PB M C , as A D C C , or m ediated by hum an serum , as C D C . W e found the acti vity of anti tum or cells w as noted i n investigation of SK O V 3 cells its m axim um inhibition rate of approxim ately 32% and 50% , w hich indicated effect factor (peri pheral blood m ononu clear nuclear cells or com plem ent), could i m prove the 3C 12 m onoclonal anti body cytotoxici ty to tum or cells. 2. Studies oil the an ti-tu m or effects of Sp l7 im m u n oconju gate in vitro an d in vi vo A lt hough 3C 12 i nhi bit the grow th of tum or cells in vi tro by the effect of A D C C and C D C , the inhibition eff ect is lim ited. In this part, w e investigated w hether a novel im m unoconjugate containi ng 3C 12 linked to a chem otherapeutic agent D O X had antitum or activi ty against o v arian c an cer c ell lin e s an d tu m o r m o d els. T h e re su lts sh o w ed th e 3 C 12 -D O X im m unoconjugate specifically bounded to Sp l7-positive SK O V 3 but not to Sp l7-negative cells and w as i nternalized by SK O V 3 cells. T reatm ent w ith 3C 12-D O X decreased the viabili ty of SK O V 3 cells in an Spl7-specific m anner. Flow cytom etry resul ts w ere also found 3C 12-D O X im m unoconjugates could induce SK O V 3 cel ls and H 0 89 10 cells apoptosis i n vi t ro. In vi vo SK OV 3 cel ls (1 x 106) w ere i nocul ated subcutaneousl y i nt o the ri ght fl anks of athym ic nu/nu fem ale m ice and developed pal pable tum ors. 3C 12-D O X treatm ent, com pared w i th control treatm ent, caused regression of established tum ors of the m ice w i th SK O V 3 cells. The anti tum or eff ects of 3C 12-D O X therapy w ere significantly related to increased apoptosi s of tum or cells. In addi tion, 3C 12-D O X show ed no observable adverse effects or toxici ty w hen com pared w i th D O X alone in m ice bearing ovari an tum or xenograft s. In sum m ary, this study explores the target antitum or activi ty of 3C 12 and the i m m unoconjugate (3C 12-D O X ) from cellular and w hole anim al level. W e found that effect factor could i m prove the 3C 12 m onoclonal anti body cytotoxicity to tum or cells; especiall y 3C 12-D O X conjugates had obvious inhibition effect of tum or, and i ts securi ty w as better than the single use of D O X . B ased on these fi ndi ngs, w e provided a pow erful experim ental basis that Spl7 w as an at tractive target for tum or targeti ng therapy. T herefore, 3C 12-D O X has been IV A b stract identifi ed as a potential antibody-drug conjugate for cli ni cal developm ent. K eyw ords: Sp l7, 3C 12, 3C 12-D O X im m unoconjugate, target therapy, o v arian can cer v 目录 目 录 I A b stract Ill 第一 章 绪 论 1 第二章 抗 Spl7 单克隆抗体体外抗肿瘤实验研究 4 第一部分 Spl7 单抗的纯化和 Spl7 蛋白在卵巢癌细胞株中的表达 4 1 主要实验材料 、试剂和仪器 4 2 实验方 法 7 2.1 Spl7 单克隆抗体的纯化 7 2. 2 间接 E L ISA 法测 定纯化抗 体 的效价 8 3 实验 结果 8 3.1 B radford 蛋 白标 准 曲线 8 3. 3 Spl7 单抗效价测定 9 4观10 第二部分Spl7 蛋白在卵巢癌细胞株中的表达 12 1 主要实验材料 、试剂和仪器12 2 实验方法 12 2.1 卵巢癌细胞 的培养12 2. 2 卵巢癌细胞蛋 白的提取12 2. 3 Spl7 蛋白在三种卵巢癌细胞中的表达 13 2. 4 细胞 ELISA 检测 3C 12 单抗与天然 Spl7 蛋白的结合 14 3 实验 结果 14 3.1 Spl7 蛋白在三种卵巢癌细胞中的表达结果 14 3. 2 细胞 ELISA 检测 3C 12 单抗与天然 Spl7 蛋白的结合 15 3.聽15 第三部分 3C 12 对 SK O V 3 细胞的增殖抑制作用 17 1 主要 实验材料 、试 剂和 仪器 17 2.实验 方法 17 2.1 SK 0 V 3 细胞 、H 0 8910 细胞和 C 0 C 2 细胞 的培养 : 17 2. 2 M T T 比色法检测 3C 12 单抗对肿瘤细胞 的增殖抑制作 用 17 2.3 统 计学分析 18 3. 实验 结果18 3.1 3C 12 单抗对肿瘤 细胞 的增殖抑制作用 18 4 观19 第 四部分 3C 12 单抗对 SK O V 3 细胞的 A D C C 和 C D C 作用21 1 主要 实 验材料 、试 剂 和 仪 器 2 1 2 实验方法21 2.1 SK 0 V 3 细胞和 C 0 C 2 细胞 的培养21 2. 2 外周血单个核细胞(PB M C )的分离21 2. 3 A D C C 检测 22 2. 3 C D C 检 测 23 2. 4 统计 学 分析 23 3.实 验 结 果 23 3.1 3C 12 组对 SK O V 3 细胞和 C O C 2 细胞 的 A D C C 作 用 23 3. 2 3C 12 对 SK 0 V 3 细 胞和 C 0 C 2 细胞 的 C D C 作用 24 第三 章 3C 12-D O X 偶 联物 抗 肿瘤 实验研 究 26 第一部分 Spl7 单抗-阿霉素偶联物体外抗肿瘤实验研究26 1 主要 实验材 料 、试 剂和仪 器 27 2 实验方法27 2.1 细胞 ELISA 检测 3C 12-D OX 偶联物与天然 Spl7 蛋白的结合 27 2. 2 3C 12-D O X 偶联物 对 靶细 胞 的增殖抑制 作用 28 2. 3 3C 12-D O X 偶联物对肿瘤细胞的凋亡检测 ( 参照试 剂盒 ) 28 目录 2. 4 统计 学 分 析 29 3 实验结果 29 3.1 3C 12-D O X 偶联物与天然 Spl7 蛋白的结合力检测29 3. 2 3C 12-D O X 偶联物对 靶细胞 的形态学观察 29 3. 3. 3C 12-D O X 偶联物对 靶 细胞 的增殖抑制作 用 29 3. 4 3C 12-D O X 偶联物对 靶细胞 的凋亡检测 30 4. 讨论 3 1 第二部分 Spl7 肿瘤动物模型建立 33 1 主要 实验材料 、试 剂和 仪 器 33 2 实验方法 33 2.1 SK O V 3 细 胞 培 养 : 33 2. 2 肿瘤 动物 模 型 的建立 33 2. 3 裸 鼠瘤 体生长情 况 的观 察34 3 实验 结果 ? ? 34 3.1 裸 鼠瘤体生长情况 的观察34 3. 2 裸鼠肿瘤 Spl7 表达的检测结果 35 4 職35 第三部分 3C 12-D O X 偶联物体 内抗肿瘤实验研究 37 1 主要实验材料 、试 剂和 仪器 37 2 实验方法 38 2.1 荷瘤 裸 鼠的分 组 38 2. 2 荷瘤裸 鼠的免疫 治疗 38 2. 3 A ST 、L D H 、C K -M B 、M D A 和 SO D 的检 测 38 2. 4 肿瘤 组 织 凋 亡 检 测 38 3 实验 结果 39 3.1 体 内实验 3C 12-D O X 对实体瘤的抑制作用 39 目录 3. 2 Spl7 免疫偶联物与 D O X 毒性比较40 4讨 论 4 1 结论和 展望 42 隱44 纖45 5 1 在读硕士期间发表 的论文 57 S t i f 58 第一章 绪论 第 一 章 绪论 卵巢癌 ( ovarian cancer, 0 C ) 为妇科生殖器官常见恶性肿瘤之一 ,其死亡率居妇科 肿瘤首位,主要原因在于 0 C 缺乏有效的早期诊断措施和肿瘤转移。晚期 0 C 的治疗 方法 是切除肿瘤 组织 再加 以辅助 的化学疗法 ,尽管顺铀 、卡怕 等化 学疗法对 大多数 的 0 C 患者有疗效 ,然而它针对全身性的使用化疗药物 ,不仅对癌症组织和细胞有杀伤作 用 ,而且会 引起机 体 的 肾脏 、肝脏 、肺 等器 官正常功 能 的衰 竭和 骨髓 细胞 、肠粘膜细胞 坏死等 ,副作用较大 ,很 多患者难 以耐受 ,效果也不理想 ,多数 患者仍会复发 。在 0 C 晚期IIIc 阶段和 IV 阶段 中,能够存 活 5 年 的患者分别约 占 29% 和因此 ,创新治 疗 方 法 ,研 发新 药物 尤 为重 要 。 1975 年 ,K ohler和 M ilstei n 首先报道 了用细胞杂交 技 术创建 了 B 细 胞杂交瘤细胞株 , 获得了抗绵羊红细胞(Sheep Red Bl ood Cel l,SRB C)的单克隆抗体( m A bs) 5。未经修饰的 “ 裸” 的 m A bs 能够 与肿瘤细胞表面抗 原特异性结合 ,产生一定的治疗 效果 。单克隆抗体 和基 因工程 的发展使科学家设想通过在抗体上偶联细胞毒性药物增加 治疗效果 :以抗体 为载体,通过交联剂连接上药物,生产了抗体药物偶联物(anti body drug conjugates, ADCs), 由此癌症的祀向治疗进入了全新的时代 6 , 7。 临床实验表明, 相对于化学疗法和 抗体疗法 ,A D C s 能减少对机体 的毒副作用 ,提高患者 的耐受性 ,并显著增加抗肿瘤 的 效果。单抗祀向治疗可能是卵巢癌治疗的新途径 8, 9。 随着 0 C 相关抗 原陆续被发现 ,推动 了治疗 0 C 的单抗药物 的幵发 ,如常用 的 0 C 的血清肿瘤标记物 C A 125 抗原又称 M U C 16 抗原 ,可用于衡量治疗效果 ,监测 0 C 的复 发,是祀向治疗的範标之一 1 0 ,阿巴伏单抗 ( abagovom ab) 是鼠源的抗 CA 125 的抗 独特 型单抗 , 用 于 晚期 0 C 患者化疗 后恢复的巩 固治疗现处在III期 临床试 验 阶段 , 此外还有 oregovom ab 单抗( 又称 OvaRex 和 B43. 13)和 OC 125 等 1 6 i 7 。 目前, 抗 CA 125 单抗被用于合成一种基因工程化的抗体蛋白质,能为特定的药物等提供偶联位点 1 8 , 且 不影响蛋白本身的折叠和功能,用来制成抗体-药物偶联物来治疗肿瘤 1 9。血管内皮生 长因子 ( V ascular endothelial grow t h factor, V E G F ) 在多数的 O C 患者中表达,表达水平 1 第一章 绪论 的高低 反 映肿 瘤 血 管 内皮 细 胞增殖 和 迁 移 水 平 的大 小21 。人 源 化 贝伐 单 抗 (B evacizum ab ) 祀 向 V E G F ,干 扰 V E G F 受体 ,抑 制 血 管 的生长 ,减 小血 管 的直径 、 密度和通透性,2006 年其被 FD A 正式批准与紫杉醇和卡铀联合用于治疗肺癌P2, 23。临 床研究发现, B evacizum ab 和卡钻-紫杉醇、 环碟酰胺等联用对晚期 0 C 有明显效果 24, 25。 综上 ,单 抗及 其 偶 联 物在 0 C 的辅 助诊 断和 临床 试 验 治 疗 中 已取 得 显著 成 果 ,弥 补 了传 统治疗 的不足 ,但还 是没 有 得 出令人信 服 的临床 随机 试验 结果 。 Spl7蛋白是高度保守的哺乳动物蛋白,在正常人睾丸中、精母细胞、精细胞以及成 熟精子中特异性表达, 而在其它组织中几乎不表达 26。 3917蛋白的生物学功能尚未明了, 就目 前所知其参与精子的顶体反应, 促进受精过程 27 。 国内外文献表明Spl7基因在多发 性骨髓 瘤 、原发性 卵巢癌 患者等 肿瘤 组织 中高水 平 表达 ,是一种新 的肿 瘤 相关抗 原 ,并 归属为癌瘤-睾丸抗原 ( CT-Ag) ,即CT- 22,是肿瘤勒向治疗的理想勒标 气本课题组 前期研究发现,Spl7蛋白参与卵巢癌的病理过程,通过将H 0 8910细胞经Spl7+质粒转染 后高表达Spl7蛋白,结果发现H 08910细胞侵袭性增强 29; 另有研究发现,从卵巢癌患 者及正常人外周血中分离出细胞毒T淋巴细胞,于体外将其与Spl7蛋白共孵育后生成致 敏特异性细胞毒T 淋 巴细胞 ,将其注入荷瘤小 鼠体 内,可根除 已转移 到小 鼠体 内的人卵 巢癌细胞, 而且小鼠未出现其他不 良的免疫反应虽然这些已有研究工作提示Spl7 蛋 白可能作 为特异性免疫治疗 的範 点 ,但其作用 的发挥依赖 于患者体 内的人 白细胞抗原 -1, 其应用存在着很大的局限性。 因此, 仍需寻找新的利用Spl7蛋白治疗卵巢癌的的方法, 利用抗Spl7单克隆抗体治疗卵巢癌的研究势在必行。 阿霉素是广谱 的抗癌抗菌素 ,其作用方式 、抑瘤效果、剂量依赖毒性 的机制 、药代 动 力学和检测 体液 中药物 浓度 的方法等 比较 明确 ,广泛用于乳腺癌 、前列腺癌 、卵巢癌 等癌 症 治疗 中由于D X 的毒 性 强和 副 反应 大 ,如 引起 心脏 毒 性 、骨 髓 抑 制 、 脱 发 、 恶 心等 ,临床 上对其 治疗 剂量控 制 严格 ,而 且重 复使 用 后肿瘤 细胞会 产 生 耐药性 ,这 些 都 限制 了阿霉 素 的应用 。因此将D O X 与单克隆抗 体偶联 ,增强其对肿瘤 的祀 向性 ,有助 于降低D O X 全身使用剂量,从而降低其毒副作用,扩大使用范围 34。 在了解国外研究背景的基础上,我们设想将Spl7作为肿瘤治疗的IE点,在国家 自然 2 第一章 绪论 科学基金 ( 项 目编 号30670599 ) 和 国家 青年 自然 科 学 基金 ( 项 目编 号81101978) 资助下 , 幵展了一系列研究工作。本实验室已经制备了高特异性和亲和力的抗Spl7单克隆抗体 (己经获得国家发明专利授权,专利号200510094178. 8) 35, 计划将其与“ 弹头” 药物阿 霉素偶联,形成抗体药物偶联物,在确保其抗体免疫活性不受影响的前提下,考察Spl7 单抗及其 免疫偶 联物在 体 内外抗肿瘤活性及祀 向性 ,开发具有应用前 景 的卵巢癌抗体革 巴 向药物 。 3 第二章 抗SpI7单克隆 抗体 体外 抗 肿瘤实 验研究 第二章 抗 Sp17 单克隆抗体体外抗肿瘤实验研 究 本课题组前期已成功对人Spi7基因克隆、 体外大量表达spn 重组蛋白,并利用单克 隆抗体技术,制备出高质量的抗人Spl7单克隆抗体株,为进一步研究单克隆抗体抗肿瘤 作用奠 定 了基础 。 本章首先选取利用能分泌 Spl7 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ( 3C 12) 制备大量单抗 蛋 白,通过 间接 E L ISA检测其抗体活性 ;同时利用免疫 印迹和免疫突光 的方法检测三 种卵巢癌细胞株中 Spl7 蛋白的表达水平情况;使用细胞 ELISA 方法检测抗 3C 12 与天 然 Spl7 蛋白 ( 细胞内)的结合力;最后利用体外实验检测 3C 12 对肿瘤细胞的增殖抑制 效应 、A D C C 效应和 C D C 效应 ,并对各实验结果进行数据统计 比较和讨论 。 第一部分 Sp17 单抗的纯化和 Sp17 蛋白在卵巢癌细胞株 中的表达 精子蛋白 17 (sperm protei n 17, Spl7) 是一种新的肿瘤相关抗原,其异常表达于多 发性骨髓瘤、卵巢癌等肿瘤组织细胞中,在正常组织中不表达或低表达 ( 睾丸) 26。因 此,我们认为 Spl7 可以作为肿瘤在体分子影像学诊断和生物学治疗的勒标本部 分将进行抗 Spn 单抗的纯化及其效价的测定, 制备纯化出髙效的 Spl7 单抗蛋白, 为进 一步体外实验打下基础 。 1 主要 实验材料 、试剂和仪 器 1.1 主要仪器 超净工作 台:苏州净化设备厂 C O 2 细胞培养箱 :美国 Percision Scienti fic 光 学 显 微镜 :G al en 公 司 焚光显微镜:日本 O l ym pus 公司 H D -4 电脑核酸蛋 白检测仪 :南京大 学南达生物技术 开发公司 台式冷冻干燥 机 :美 国 FT S 公司 蛋 白电泳转 印系统:B io R ad 公 司 B io-R ad M odel 680 型酶 联仪 :伯 乐公 司 4 第二章 抗Spl7单克隆 抗体体外 抗肿瘤实 验研究 1.2 材 料 和试 剂 1.2.1 细胞 培养 所 需试 剂 (1)PB S 缓冲液:8 g N aC l、0. 2 g K Cl 、2. 08 g N aH P0 4 和 0. 2 g K H 2PO 4 加入 800 m L 三 蒸水溶解,定容至 1 L ,调节 pH 至 7. 4; (2) RM PI1640 完全培养液:取一袋 RM PI 1640 培养基(G i bco 公司)粉剂加入 950 m L 三 蒸水充分溶解,再加入 2 gN aH C 0 3 、0. 3 g L-谷氨酷胺和 10 万单位的青霉素和链霉素 搅拌溶解定容至 1L ,调节 pH 至 7. 0,过滤除菌,分装备用,4 C 保存; (3) 0. 25% 胰酶: 0. 5 m g 胰酶(Sigm a 公司), 加 PB S 缓冲液定容至 200 m L ,调节 pH 至 7. 4, 过滤 除菌 ,分装 4 C 保存 ; (4) 细胞裂解液:碧云天生物技术研究所 1. 2. 2 EU SA 试 剂 (1) 包被液: 碳酸钠 1. 59 g, 碳酸氧钠 2. 93 g 加入 ddl O 定容至 100 m L ,调节 pH 至 9. 6, 尚压灭 囷备用 ; (2) 抗体稀释液:取 1 m L 小牛血清加入 99 m L PB S 缓冲液,溶解备用; (3) 洗漆液、显色液和终止液等:上海科华公司 (4) H RP 标记的羊抗鼠的 IgG : 南京川博生物公司 1.2.3 抗体 纯 化所 需试 剂 (1) 饱和硫酸按(SA S): 500 g 硫酸按加入 500 m L ddH aO , 加热至完全溶解,室温过夜, 析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的 SA S 用量,用氨水调节 pH 至 7. 0; (2) 萘氏试剂: 碘化萊 11. 5 g, 碘化钾 8 g, 力 n 50 m L ddH 20 , 待溶解后, 再加 20% N aOH 溶 液 50 m L ; (3) 0. 1 M甘氨酸-H C1缓冲液: 0. 75 g 甘氨酸加入 16. 8 m L 0. 2 M H C1中, ddH zO 定容至 200 m L ,调节 pH 至 2. 7,4 C 保存; (4) 1 M Tri s-H Cl 缓冲液:0. 61 gTris 力 口 入 5 m L 0. 1 M H C1 中,ddH aO 定容至 100 m L ,调 节 pH 至 9. 0, 4C 保存; (5) 考马斯亮蓝 G -250 染液:将 0.1 g 考马斯亮蓝 G -250 溶于 50 m L 95% 乙醇,加入 100 m L 磷酸溶液,定容后混匀,过滤 ,4C 保存; 5 第二章 抗Spl7单克隆 抗体体外抗肿瘤实 验研究 1. 2. 4 SDS-PAGE 及 Western b lot 所 需试剂 (1) 30% 两稀酰胺溶液: 丙稀酰胺 29 g、 甲叉双丙稀酰胺 1 g, 溶解于 ddH zO
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本文标题:Sp17单克隆抗体及其阿霉素免疫偶联物靶向治疗卵巢癌的实验研究
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