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T细胞因子4在毛囊毛乳头细胞中的表达及其功能研究

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细胞因子 毛囊 乳头 细胞 中的 表达 及其 功能 研究
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第三军医大学 博士学位论文 T细胞因子4在毛囊毛乳头细胞中的表达及其功能研究 姓名:刘毅 申请学位级别:博士 专业:皮肤病与性病学 指导教师:郝飞 20080501 第三军医大学博士学位论文 T 细胞因子4 在毛囊毛乳头细胞中的表达及其功能研究术 摘要 一、研究背景与目的 位于毛囊基底部的特殊间质成分毛乳头细胞( d e r m a lp a p i l l ac e l l ,D P c ) 在毛囊发育 和周期性再生调控中起主导作用。在胚胎期,D P C 产生多种针对表皮的调节因子,促使 表皮细胞增生分化形成毛囊。出生后毛囊的周期性再生过程中诱导上皮细胞增殖和分 化的信号也来自D P C 。诱导毛囊形成是D P C 最为显著的功能特征,D P c 功能的异常 变化是导致毛囊周期失衡和脱发现象的主要起始因素。因此对D P C 生物学功能变化的 调控机制进行深入研究,对毛囊生物学和毛发疾病的研究都有重大的意义。相关研究 先后鉴定出数十种与D P C 相关的调控因子,这些调控因子在D P C 和毛囊上皮细胞的 相互作用中构成复杂的调控网络,但尚不能确定其中具有关键作用的因子或调控途径。 研究表明,细胞在不同的生物学功能状态中表达的基因不同,基因表达的有序性、 选择性是细胞功能变化的内在根据。因此,通过分析不同状态下D P C 基因表达的差异, 可为揭示D P c 生物学功能调控规律提供重要信息。获取差异表达的基因将有助于了解 D P C 在生理和病理条件下功能变化的分子机制,为毛囊发育和毛囊周期性生长调控研 究提供新的视野。 在以往的研究中,本课题组使用抑制性消减杂交技术( S S H ) 结合S M A R T T Mc D N A 合成技术对人活体组织中休止期毛囊D P c 及生长期毛囊D P cm R N A 的表达差异进行 了研究。S S H 方法通过两轮杂交和抑制性P C R ,可对两个样本的基因表达进行有效对 比。运用S M A R T l Mc D N A 合成技术合成c D N A ,使对活体组织毛乳头标本进行基因 表达差异研究成为可能。最终我们成功建立了毛乳头差异表达c D N A 文库,为进一步 阐述D P C 功能调控的分子机制奠定了基础。 从所建立的毛乳头差异表达c D N A 文库中,我们首次发现了W n t 信号通路关键信 号分子T 细胞因子4 ( Tc e l lf a c t o r 4 ,T C F 4 ) 作为生长期毛囊D P C 的上调表达基因,并使 用反向N o r t h e m 实验对该结果进行了验证。T C F 4 在D P C 中差异表达为首次发现,生 + 国家自然科学基金资助项目( N 0 3 0 5 0 0 4 4 2 ) 6 第三军医大学博士学位论文 物学意义尚不明了。本课题拟研究D P C 在凝集性生长和非凝集性生长状态下的T C F 4 基因表达差异,以及对T C F 4 基因在D P C 生物学功能调控中的作用进行实验研究。 二、方法与结果 1 T C F 4 基因在毛囊D P C 中的表达 首先应用原位杂交技术检测斑秃患者和正常人头皮组织的T C F 4 基因的表达;应 用细胞免疫荧光检测凝集性生长和非凝集性生长的人D P C 的T C F 4 蛋白的表达; R T - P C R 的方法从上述两种细胞的总R N A 扩增T C F 4 基因。结果发现T C F 4 基因在正 常头皮组织毛囊D P c 表达,而在斑秃组织毛囊的D P c 不表达;T c F 4 基因在凝集性生 长期D P C 中表达,而在非凝集性生长期D P C 不表达。表明T C F 4 基因在生长期D P C 中高水平表达。 2 p c D N A 3 0 T C F 4 表达载体的构建及表达 为了研究T C F 4 基因对D P C 增殖的影响,我们构建了p c D N A 3 O T c F 4 表达载体。 首先从凝集性生长D P C 中提取总R N A ,R T 。P C R 获得带有酶切位点的T C F 4 基因克隆, 亚克隆入p c D N A 3 O 载体中,并通过双酶切和测序进行鉴定。利用脂质体2 0 0 0 转染到 D P c 中进行稳定表达,检测转染前后T c F 4 表达的变化。以未转染的D P C 作为对照组, 分别用流式细胞仪检测D P C 细胞周期的变化,W e s t e r nb l o t 检测D P C 的肝细胞生长因 子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ,H G F ) 、干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r ,S C F ) 的表达,M T T 比色法检测细胞生长曲线,3 H T d R 检测细胞增殖。结果表明,我们从D P C 中获得T C F 4 基因克隆并且成功构建了真核表达载体。经过稳定转染,D P C 中T c F 4 在m R N A 和蛋 白表达水平上调。与对照组相比,D P C 的增殖能力和相关细胞因子的分泌能力得到明 显提高。结果表明,T c F 4 基因可以促进D P c 增殖和分泌细胞因子的功能。 3 R N A 干扰抑制T C F 4 表达对D P C 生物学功能的影响 为了进一步探讨T C F 4 的表达对D P C 细胞生物学功能的影响,我们采用化学合成 法合成3 对T c F 4s i R N A ,并转染D P c 。采用半定量R T P c R 及w e s t e mb l o t 分别从 m R N A 和蛋白质水平检测D P CT C F 4 的表达情况。以未转染s i R N A 的D P C 作为对照 组,用流式细胞仪检测D P C 细胞周期的变化,W e s t e mb l o t 检测D P C 的胰岛素样生长 因子一l ( i n s u l i n i i k eg r o w t hf a c t o 卜l ,I G R l ) 和s c F 的表达,M T T 比色法检测细胞生长 曲线,3 H T d R 检测细胞增殖。结果表明与空白对照组相比,3 组序列的m R N A 和蛋 白质表达均有明显降低,以序列2 组下降明显。细胞增殖能力均显著下降( P < 0 0 5 ) , 7 第三军医大学博士学位论文 I G F l 、S C F 表达明显降低,而对照组无显著性差异。结果表明T C F 4s i R N A 能显著下 调D P CT C F 4 的表达,降低D P C 的增殖能力,进一步提示T C F 4 在D P C 生长调控中 可能起到重要作用。 三、结论 1 T C F 4 基因在生长期D P C 中高表达。 2 。T C F 4 基因在D P C 中过表达使其细胞周期、生长曲线明显改变,细胞增殖明显 增强,并促进D P C 分泌细胞因子。 3 通过R N A 干扰降低T C F 4 基因的表达,可使D P C 细胞增殖减慢,相关细胞因 子的分泌受到抑制。 通过以上实验,为深入了解T C F 4 基因以及w n t 信号在毛囊周期性调控中的作用 和机制奠定了基础。 关键词:毛乳头细胞;T 细胞因子4 ;基因表达;W n t 信号;细胞增殖;细胞因 子;R N A 干扰 第三军医大学博士学位论文 E x p e r i m e n t a lS t u d yo nt h eE x p r e s s i o na n dF u n c t i o no f T C F 4i nD e r m a lP a p i U aC e l l so fH a i rF o U i c l e 冰 B a c k g r o u n d sa n do b j e c t i v e s A b s t r a c t D e m a lp a p i l l ac e l l s ( D P C ) ,l o c a t e di nb a s e m e n to fh a i rf o I I i c I e ,p l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nm o 叩h o l o g yd e V e l o p m e n ta n dc y c l er e g u l a t i o no fh a i rf o l l i c l e D u r i n gt h ee m b r y op e r i o d , D P Cs e c r e tV a r i o u sc y t o k i n e st op r o m o t ep r o l i f e r a t i o no fe p i d e r m a lc e l l sa n df o r m a t i o no f h a i rf o l l i c l e A f t e rb i n h ,t h em a i nb i 0 1 0 9 i c a lf u n c t i o no ft h eD P Ci st oi n d u c et h eh a i r f 0 1 l i c l ef o r m a t i o n T h ea b n o r m a l i t yo ft h eD P Cf u n c t i o nc a nc a u s et h ei m b a l a n c eo ff o l l i c l e g r o w t hc y c l ea n dh a i rl o s s ni sm e a n i n g f h lf o ru st os t u d yt h eb i o l o g i c a lr u l eo fD P C i n h a i rf o l l i c l e 。R e c e n ts t u d i e sh a V ef o u n dt h a tD P Cw e r er e l a t e dt os e V e r a lk i n d so fr e g u l a t i n g f a c t o r s ,w h i c hc o n s t i t u t e dac o m p l i c a t e dn e t w o r k S of a r ,w ec a n n o ti d e n t i f yt h ek e yf a c t o r i nt h i sn e t w o r k S t u d i e sh a V ep r o V e dt h a tc e l l si nt h ed i f f e r e n tb i 0 1 0 9 i c a lf U n c t i o ns t a t u se x p r e s s d i f f e r e n tg e n e s T h e r e f o r e ,t h ea n a l y s i so ft h ed i f f e r e n tg e n e se x p r e s s e db yD P Cc a nr e V e a l t h em o l e c u l em e c h a n i s mo fD P Ci nd i f 先r e n tb i o l o g i c a lf u n c t i o n ss t a t u s ,w h i c hp r o V i d en e w w a y st os t u d yt h er e g u l a t i o no f h a i rf o l l i c l eg r o w t h I np r e v i o u sw o r k ,w e v ei d e n t i f i e dt h ed i f f e r e n t i a lg e n e se x p r e s s e db ya n a g e nd e r m a l p a p i l l aa n dt e l o g e nd e m a lp a p i l l ab yu s i n gs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i V eh y b r i d i z a t i o n ( S S H ) a n d S M A R T T Mc D N A S S Hc a nb eu s e dt oc o m p a r et h ed i f f e r e n tg e n e se x p r e s s e db yt w o s a m p l e sb yt w or o u n d so fh y b r i d i z a t i o na n ds u p p r e s s i V eP C R I ti sf e a s i b l et os c r e e no u tt h e d i f 亿r e n te x p r e s s i o ng e n e si nD P Ct h r o u g hs y n t h e s i z i n gc D N Ab yS M A R T T Mc D N A t e c h n o l o g y F i n a l l y ,w eh a V ec o n s t r u c t e dt h ec D N Al i b r a r yo fD P C ,w h i c hi st h ef o u n d a t i o n f o rf u n h e rs t u d y i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fD P Ci nf o l l i c l eg r o w t hc y c l e I ti st h ef l r s tt i m ef o ru st of i n dt h a tTc e l lf a c t o r4 ( T C F 4 ) i sd i f f e r e n t l ye x p r e s s e di n D P Ci nd i f f e r e n tb i o l o g i c a lf - u n c t i o n ss t a t u s B u ti t sb i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c ei su n c l e a r I nt h e + T h i sp r o j e c tw a ss u p p o n e db yag r a n df r o mt h eN a t i o n a l N a t u r eS c i e n c eF b u n d a t i o no fC h i n a ( N o 3 0 5 0 0 4 4 2 ) 第三军医大学博士学位论文 e D N Al i b r a r yo fD P C ,w eh a V ef D u n dt h ee x p r e s s i o no fT C F 4g e n ew a su p r e g u l a t e di n a n a g e nd e m a lp a p i l l a ,a n dt h er e s u l t sh a V eb e e nc o n f i r m e db yu s i n gr e V e r s eN o n h e m T h e a i mo ft h es t u d yi st oi n V e s t i g a t et h ee x p r e s s i o na n df U n c t i o no fT C F 4i nD P Co f h a i rf o l l i c l e , M e t h o d sa n dR e s u l t s 1 T h ee x p r e s s i o no fT C F 4g e n ei nD P C F i r s t l y ,h y b r i d i z a t i o ni nJ 豇“w a su s e dt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fT C F 4g e n e e x p r e s s e d i n a l o p e c i aa r e a t a ( A A ) a n dn o r m a lh u m a n s c a l p t i s s u e S e c o n d l y , i m m u n o c h e m i s t r yw a su s e dt oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fT C F 4p r o t e i ni nD P C w i t ha n d w i t h o u ta g g r e g a t i V eb e h a V i o u s F i n a l l y ,R I T P C Rw a su s e dt oa m p l i f yT C F 4g e n ef r o mt h e t o t a lR N Ao fD P C W ef o u n dt h a tT C F 4g e n ee x p r e s s e di nD P Co fn o r m a lh u m a ns c a l p , a n di tw a sn o tf b u n di nD P Co fs c a l pf r o ma l o p e c i ap a t i e n t s T h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t T C F 4g e n eh i g h l ye x p r e s s e di na n a g e nD P C 2 T h ec o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no f p c D N A 3 O - T C F 4e x p r e s s i o nV e c t o r I no r d e rt os t u d yt h ee f f e c to fT C F 4i nt h ep r o l i f e r a t i o no fD P C ,w ec o n s t r u c t e dt h e p c D N A 3 O T C F 4e x p r e s s i o n V e c t o r F i r s t ly ,w ee x t r a c t e dt h et o t a lR N Af r o mt h e a g g r e g a t i V eD P C T C F 4g e n ew a sg o t t e nb yR T P C R ,a n dw a si n s e r t e di n t ot h ee u k a r y o t i c e x p r e s s i o nV e c t o rp c D N A 3 O T h es e q u e n c ea n dr e a d i n gf r a m ew e r ec o n f i r m e db yt w o r e s t r i c t i o ne n z y m e sa n ds e q u e n c i n g T h er e c o m b i n a n tV e c t o rp c D N A 3 O T C F 4w a ss t a b l y t r a n s f 色c t e di nD P Ca n dt h ee x p r e s s i v ec h a n g e so fT C F 4g e n ew e r ed e t e c t e d D P Cw i t h o u t t r a n s f e c t i o nw a Su s e dt ob ea st h ec o n t r o l ,T h ec e l l c y c l ew a sd e t e c t e db y f l o w c y t o m e t r y T h ec o n c e n t r a t i o n so fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ( H G F ) a n di n s u l i ng r o w t h f a c t o rl ( I G F 一1 )w e r ed e t e c t e db yW e s t e r nb l o t W ee x a m i n e dt h e g r o w t hc u r V eb y 3 一( 4 ,5 一d i m e t h y l t h i a z o l - 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r e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fT C F 4a n dl o w e rt h ep r o l i f 色r a t i o no fD P C S o ,T C F 4p l a y s a J li m p o n a n tr o l ei nr e g u l a t i n ga n dc o n t r o l l i n gt h eg r o w t ho fD P C C o n c l u s i o n s 1 T h ee x p r e s s i o no fT C F 4g e n ei su p r e g u l a t e di na n a g e nD P C 2 T h eo V e r e x p r e s s i o no fT C F 4i nD P C c h a n gc e l lc y c l ea n dg r o w t hc u r V e ,e n h a n c et h e p r o l i f e r a t i o no fD P C a n dp r o m o t et h es e c r e t i o no fc y t o k i n e s 3 T h ee x p r e s s i o no fT C F 4g e n ei sd e c r e a s e db ys i l e n c i n gt h eT C F 4g e n e ,w h i c hs t e p d O w nt h ep r o l i f e r a t i o no fD P Ca n di n h i b i t e dt h es e c r e t i o no fr e l e V a n tc y t o k i n e s T h ep r e s e n te x p e r i m e n tl a yt h ef o u n d a t i o nf o rf u n h e rs t u d yt h er o l eo fT C F 4g e n ea n d W n ts i g n a lp a t h w a yi nr e g u l a t i n ga n dc o n t r 0 1 l i n gt h ef o U i c l ec y c l e K e yw o r d s :d e r m a lp a p i l l a ec e l l s ; T C F 4 ;W n ts i g n a l : g e n ee x p r e s s i o n ; p c D N A 3 0 e x p r e s s i o nV e c t o r ; c o n s t r u c t i o n ;R N Ai n t e r f e r e n c e 5 第三军医大学博士学位论文 缩略语 A m p A P S B i s C D K C d d H ,O d s R N A D E P C D M E M D M S 0 D P C d s D N A D T T D v l E B F C S h H G F I G F I I F k b k D a m l n M T T P A G E P B S 缩略语表 英文全称 a m p i c i l l i n a m m o n i u mp e r s u l p h a t e b i s a c r y l a m i d e c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e c y e l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r d o u b l ed i s t i l l a t e dw a t e r d o u b l e s t r a n d e dR N A d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e D u l b e c c o sm o d i f i e dE a g l em e d i u m d i m e t h y ls u l f b x i d e d e m a l p a p i l l ac e l l d o u b l es t r a n d e dD N A d i t h i o t h r e i t o l d i s h e V e U e dp r o t e i n e t h i d i u mb r o m i d e f e t a lc a l fs e m m h o u r h e p a t o c ”eg r o w t hf a c t o r 1 1 1 s u l i ng r o w t hf a c t o r i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c e k i l o b a s ep a i r s k i l o d a l t o n ( m o l e c u l a rm a s s ) m i n u t e 3 一( 4 ,5 d i m e t h y l t h i a z 0 1 2 y 1 ) 一2 ,5 一d i p H e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e p 0 1 y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p H o r e s i s p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e 中文全称 氨苄青霉素 过硫酸胺 甲叉双丙烯酰胺 周期蛋白依赖激酶 周期蛋白依赖激酶抑制因子 双蒸水 双链R N A 焦碳酸二乙酯 改进的E a g l e 培养基 二甲基亚砜 D P C 双链D N A 二硫苏糖醇 蓬乱蛋白 溴化乙锭 胎牛血清 小时 肝细胞生长因子 胰岛素样生长因子 间接免疫荧光 千碱基对 于道尔顿 分钟 3 一( 4 ,5 二甲基噻唑2 ) 一2 ,5 二苯基 四氮唑溴盐 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 第三军医大学博士学位论文 P C R p p m P V D F r p m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p a n sp e rm i l l i o n p o l y V i n y l i d e n ed i n u o r i d e r e V o l u t i o n sp e rm i n u t e l m P C Rr e V e r s et r a n s c r i p t a s e P C R S C F S D S D S S e C S E M s i R N A T A E T B S T C A T C F 4 T E W 1 s t e mc e l lF a c t o r s t a n d a r dd e v i a t i o n s o d i u md o d e c y l b e n z e n e s u l f o n a t e s e c o n d s t a n d a r de r r o ro ft h em e a n s m a Ui n t e r f e r i n gR N A 多聚酶链式反应 百万分之一 聚二氟乙烯 辕| 食 反转录P C R 干细胞因子 标准差 十二烷基苯磺酸钠 秒 平均值的标准误 小干扰R N A t r i s a c e t i ca c i da n dE D l A b u f f e rT r i 乙酸和乙二胺四乙酸缓冲液 t r i s - b u f f e r e ds a l i n e t r i c h l o r o a c e t i ca c i d Tc e Uf a c t o r4 t r i s H C la n dE D T Ab u f f e r W n ti n h i b i t o r yf a c t o 卜1 2 T r i s 缓冲盐水 三氯乙酸 T 细胞因子4 T r i s 盐酸和乙二胺四乙酸缓冲液 W n t 抑制因子1 第三军医大学研究生学位论文独创性声明 秉承学校严谨的校风和科研作风,本人申明所呈交的论文是我本人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别 加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果,也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料, 与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作者签名:壹2 豇日期:型二兰! 第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ,可 以采用影印
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本文标题:T细胞因子4在毛囊毛乳头细胞中的表达及其功能研究
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